Recuperação sensório-motora após transecção e reparo de raízes dorsais medulares com plasma rico em plaquetas (PRP) e tratamento com células tronco embrionárias humanas (hESC)

Autor(es)

Mateus Vidigal Castro

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2020-02-28

Membros da banca

Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira; Fábio Rogério; André Luis Bombeiro; Rogério Martins Amorim; Victor Túlio Ribeiro de Resende

• Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira

Resumo

A coordenação motora envolve processos neurais específicos que vão desde a percepção de seu estímulo até a realização da resposta, sendo dependente da integração sensório-motora, que é particularmente evidente na medula espinal. Sendo assim, lesões nas raízes medulares podem resultar em perdas sensitivas e motoras, dependendo da raiz afetada, o que as torna um importante problema médico. A reparação de tais lesões é uma tarefa delicada, devido à possibilidade de novos danos à medula espinal e de estruturas circunvizinhas, bem como a possibilidade de gerar dor neuropática. Desse modo, os procedimentos cirúrgicos de restauração de lesões nas raízes priorizam o reparo das raízes ventrais (componente motor), em relação ao componente sensorial (raizes dorsais). Nesse contexto, um tratamento inédito que propomos é a utilização de gel de plasma rico em plaquetas (PRP) humano, como alternativa para o reparo de raízes dorsais lesadas. Além disso, tendo em vista que a terapia celular é outra ferramenta promissora que poderia fornecer melhorias regenerativas ao local lesionado, o presente trabalho investigou os beneficios provocados pelas células-tronco embrionárias humanas (hESC) associando-as ao gel de PRP. As células em questão foram modificadas geneticamente para superexpressar o fator de crescimento de fibroblasto-2 (FGF-2; isoforma 18 kDa). Adicionalmente, também propomos a utilização de nanofibras de ácido poli L-ácido láctico (PLLA) a fim de fornecer um suporte mecânico para estabilização das raízes dorsais reparadas e utilizadas como um controle negativo. Portanto, para investigar a eficácia do gel PRP, como elemento adesivo e indutivo de regeneração axonal, bem como os benefícios das hESC modificadas, ratos Lewis fêmeas com 8 semanas de idade, foram submetidos à rizotomia dorsal unilateral (L4-L6), onde as raízes foram reparadas utilizando-se PRP, associado ou não à terapia celular (N=5; por grupo experimental). O gel de plasma rico em plaquetas (PRP) foi obtido a partir de sangue humano e caracterizado em relação à concentração, integridade e viabilidade das plaquetas. Já as células humanas foram caracterizadas, fenotipadas por citometria de fluxo e processadas para avaliar a expressão dos transcritos gênicos BDNF, GDNF, FGF-2, IGF e VEGFA, por qRT-PCR in vitro. A recuperação do arco reflexo foi avaliada semanalmente pelo método eletrônico von-Frey, durante oito semanas. As medulas espinais foram processadas para avaliar a expressão gênica (TNFa, TGFb, BDNF, GDNF, FGF2, VEGF, NGF, IL4, IL6, IL13), por qRT-PCR in vivo, 1 semana após a lesão, e alterações tanto nos circuitos sinápticos glutamatérgicos (anti-VGLUT1) como na resposta glial (anti-GFAP e anti-Iba-1) foram avaliadas por imunofluorescência, uma (fase aguda) e oito semanas (fase crônica) após a lesão. Em conjunto, os resultados do presente estudo indicam que o plasma rico em plaquetas (PRP) ativado, utilizado para o reparo das raízes medulares foi eficiente, possibilitando a reconexão física da raiz seccionada à superfície medular, de forma a permitir reinervação sensorial no ambiente medular. Desse modo, a abordagem cirúrgica ora utilizada contribuiu para a regeneração nervosa, visto pela restauração da rede sináptica (glutamatérgica) e a não exacerbação da atividade glial (que pode ter facilitado a penetração de axônios em regeneração) nas lâminas medulares analisadas, bem como pelos resultados positivos nos testes funcionais. Além disso, o reparo das raízes com PRP apresentou efeitos imunomodulatórios, sendo que este também serviu como arcabouço para as células tronco embrionárias humanas (hESC). A terapia celular, por sua vez, não trouxe melhora adicional em termos funcionais, apesar da significativa expressão de fatores tróficos in vitro. Em conclusão, o presente estudo indica a viabilidade de reparo de raízes medulares dorsais, restaurando parcialmente a integração de inputs sensitivos e motores, com importante ganho funcional (AU)

• Processo FAPESP: 15/26206-0 - Recuperação sensório-motora após transecção e reparo de raízes dorsais medulares com plasma rico em plaquetas (PRP) e tratamento com células tronco embrionárias humanas (hESC).
• Beneficiário: Mateus Vidigal de Castro
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado