Regulação da expressão da fímbria CupD por sistemas de dois componentes de Pseudomonas aeruginosa Pa14 e ensaios de virulência no hospedeiro-modelo Dictyostelium discoideum

Autor(es)

Ana Laura Boechat Borges

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Conjunto das Químicas (IQ e FCF) (CQ/DBDCQ)
• Data de defesa: 2008-10-15

Membros da banca

Regina Lúcia Baldini; Frederico José Gueiros Filho; Julio Cezar Franco de Oliveira

• Orientador: Regina Lúcia Baldini

Resumo

Pseudomonas aeruginosa é uma gamaproteobactéria ubíqua capaz de infectar indivíduos imunocomprometidos e causar infecções hospitalares. Entre duas repetições diretas situadas na ilha de patogenicidade PAPI-1 da linhagem PA14, encontram-se dois grupos de genes transcritos em direções opostas. O primeiro, composto de pvrS, pvrR, rcsC e rcsB, codifica proteínas de sistemas de dois componentes e está relacionado com virulência, enquanto o segundo compreende cinco genes (cupD1-D5) e codifica uma fímbria do tipo chaperoneusher, com alta similaridade com o grupo cupA, envolvido na formação de biofilme em outras linhagens de P. aeruginosa. Fímbrias da mesma família são importantes na patogenicidade de outras bactérias. Com o objetivo de estudar a relação entre esses dois grupos de genes, procurou-se caracterizar sua organização por ensaios de RT-PCR, que possibilitaram observar a disposição dos genes dos sistemas de dois componentes em dois operons distintos (pvrRS e rcsCB) e, pelo menos, cupD1-cupD2 como uma unidade transcricional, com indícios apontando para a organização de cupD1-D5 em um único operon. Os inícios de transcrição e as regiões promotoras de cada operon foram caracterizados por experimentos de RACE 5 e extensão de oligonucleotídeo marcado em busca de seqüências relevantes para a ativação da expressão desses genes. Visando investigar a regulação da expressão da fímbria CupD pelos sistemas de dois componentes codificados pelos genes adjacentes, foram realizados ensaios de qRT-PCR, os quais mostraram uma menor expressão de cupD na linhagem mutante para rcsB. RcsB apresenta um domínio de ligação a DNA e, apesar da falta de sucesso em ensaios de ligação dessa proteína à região promotora de cupD, os dados obtidos por qRT-PCR 1 indicam fortemente que essa proteína funciona como um ativador de transcrição dos genes da fímbria. Corroborando esses achados, somente quando se utilizou RNA extraído de P. aeruginosa PA14 superexpressando RcsB foi possível visualizar no gel a banda referente ao início de transcrição de cupD1-D2 no ensaio de extensão de oligonucleotídeo. Ao contrário do efeito positivo de RcsB observado na transcrição de cupD1, cupD2 e cupD5, a histidina quinase RcsC atua negativamente na expressão dos genes da fímbria, sugerindo que, nesse caso, sua atividade predominante sobre RcsB seja a de fosfatase. PvrS e PvrR parecem atuar de forma indireta e positiva sobre cupD. Como um segundo objetivo do trabalho, ensaios de virulência de P. aeruginosa no hospedeiro-modelo Dictyostelium discoideum foram otimizados, com o estabelecimento de uma técnica para se testar alguns genes estudados no laboratório que podem ser relevantes para a virulência dessa bactéria. Resultados desses ensaios confirmaram a atenuação de mutantes para uma suposta metiltransferase, já observada em modelos de planta, camundongo e drosófila. Em conjunto, os resultados desse trabalho tornam-se informações valiosas para serem usadas na pesquisa de controle de infecções por P. aeruginosa, que depende de fímbrias para colonizar com sucesso superfícies abióticas que servem de veículo de disseminação desse agente infeccioso e para que as bactérias possam persistir no organismo do hospedeiro. (AU)

• Processo FAPESP: 06/02163-0 - Genes envolvidos com a patogenicidade de Pseudomonas aeruginosa PA14: caracterização das regiões promotoras e ensaios de virulência no hospedeiro modelo Dictyostelium discoideum
• Beneficiário: Ana Laura Boechat Borges
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado