Características funcionais e potencial terapêutico dos receptores Fc na inflamação sistêmica

Autor(es)

Mario Diego Teles Correia

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina (FM/SBD)
• Data de defesa: 2019-04-29

Membros da banca

Fabiano Pinheiro da Silva; Jaqueline Beppler; Murilo Chiamolera; Ricardo José Giordano

• Orientador: Fabiano Pinheiro da Silva

Resumo

Introdução: Os receptores Fc são proteínas de importância crucial no processo saúde-doença. São responsáveis pela ativação de mecanismos efetores e modulam a resposta imune e inflamatória. Têm papel central na patogênese de doenças autoimunes, sepse e doenças neoplásicas. O lúpus, protótipo das doenças autoimunes e a sepse, infecção grave que causa disfunção orgânica, são doenças inflamatórias nas quais o papel dos receptores Fc vêm sendo desvendados. Essas patologias têm alta morbidade e mortalidade, impondo enormes custos para sociedade. A descoberta que a E. coli se liga ao receptor CD16 (FcGamaRIII) para evadir-se do sistema imune, através da ligação com a proteína wzxe presente em sua membrana, torna esse receptor um alvo terapêutico interessante. O CD16 é um FcGamaR com ITAM que classicamente tem função ativadora e gera respostas inflamatórias ao se ligar a imunocomplexos. Porém, na sepse, a ligação direta com a E. coli induz uma ativação ITAMi, que bloqueia a produção de ROS e inibe a fagocitose e a morte desta bactéria. A manipulação dessa ativação inibitória (ITAMi), aparentemente anti-inflamatória, pode ser uma estratégia efetiva para o tratamento de doenças inflamatórias como a sepse e o lúpus. Inicialmente visamos avaliar a importância fisiológica e o papel terapêutico do peptídeo ligante do CD16, em modelo de sepse e em modelo de lúpus induzido por pristane, respectivamente. De maneira similar ao CD16, o CD89 (FcAlfaRI) é capaz de mediar uma sinalização dual, ativatória ou inibitória, que depende da forma como se dá sua ligação às imunoglobulinas e imunocomplexos. Por isso, num segundo momento, averiguamos se o FcAlfaRI (CD89) poderia se ligar à bactérias de maneira direta, na ausência de ligantes cognatos e mediar respostas pro ou anti-inflamatórias, protegendo ou não o hospedeiro. Metodologia: Camundongos C57Bl/6, WT e CD16KO com lúpus induzido por pristane, foram tratados com o peptídeo CYWGGTEGAC(IRG Bioscience,USA). A expressão gênica e protéica de diversas citocinas, assim como genes associados a assinaturas de interferon foram avaliados nos pulmões desses animais. Utilizamos também um modelo de sepse através da injeção intra-peritoneal de E. coli WT e E. coli mutante wzxe -/-, no qual avaliamos mortalidade e produção de citocinas. Realizamos experimentos in vitro com BMM e BMDC murinos, fagócitos humanos e bactérias. A expressão de CD89 e de receptores cognatos foi avaliada através de citometria de fluxo. Empregamos a citometria de fluxo com imagem para análise da fagocitose. Foram realizados também, experimentos in vivo com camundongos WT e transgênicos: CD89tg, CD89R209Ltg CD89tgCD16KO, CD16KO e PCRKO. Comparamos mortalidade, produção de citocinas, quantidade de bactérias e lesão tecidual em modelos de CLP e de pneumonia por administração nasal de S. pneumoniae. Produção de ROS pelos BMM foi avaliada por microscopia confocal e, nos PMN, por quimioluminescência. Imunoprecipitação e immunoblotting foram utilizados para avaliar recrutamento de syk e SHP-1. Utilizamos ELISA para ensaios de ligação de bactérias com CD89 e para quantificar TNF-Alfa, IL-1 e IL-6. Resultados: Camundongos injetados com a bactéria mutante wzxe-/- sobreviveram mais e produziram quantidade menor de citocinas reforçando o papel chave da proteína wzxe, no mecanismo de evasão imune da E. coli. Camundongos WT e CD16KO com lupus induzido por pristane, tratados ou não com peptídeo CYWGGTEGAC, não apresentaram diferenças na expressão gênica nem protéica de citocinas nem em genes associados a assinaturas de interferon em seus pulmões. O CD89 interage diretamente com bactérias gram-positivas e gram-negativas. A interação bactéria-CD89 em macrófagos murinos induz ativação celular, fagocitose e morte bacteriana, que são dependentes da cadeia FcRGama. Essa mesma interação protege contra a mortalidade em dois modelos de sepse (CLP e pneumonia) e é dependente da cadeia FcRGama e indepedente de PCR e IgA anti-bactéria. Conclusões: O CD16 e o CD89 são FcRs com ITAM que apresentam uma dualidade na forma de ativação através do ITAM, que em algumas situações pode ser inibitória (ITAMi). Nessa tese reforçamos o papel chave da proteína wzxe, ligante do CD16, como responsável pela evasão bacteriana da E. coli através de sinalização ITAMi. Por outro lado, falhamos em demostrar diferenças após o tratamento de camundongos com lúpus induzido por pristane usando o peptídeo CYWGGTEGAC. Acreditamos que isso tenha ocorrido devido a dose inadequada do peptídeo ou proteólise por enzimas endógenas do camundongo, assim que o peptídeo é injetado. Novas doses ou a manipulação da estrutura do peptídeo são perspectivas futuras para este projeto. Quanto ao CD89, provamos seu papel extremamente importante na imunidade inata. Esse receptor, à semelhança do CD16, foi capaz de ligar-se diretamente a bactérias, na ausência de opsoninas e ligantes cognatos. O CD89 foi protetor tanto para infecção por gram-positivo quanto por gram-negativo enquanto o CD16 foi protetor apenas em modelo de pneumonia por gram-positivo (AU)

• Processo FAPESP: 16/03665-1 - Desenvolvimento de novo fármaco com ação sobre o receptor CD16 para tratamento de doenças autoimunes e do choque séptico
• Beneficiário: Mario Diego Teles Correia
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto