Estudo in vitro do perfil metabólico do agente antitumoral piplartina frente às enzimas do citocromo P450 e predição de parâmetros farmacocinéticos

Autor(es)

Fernanda de Lima Moreira

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2017-02-21

Membros da banca

Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira; Thiago Barth; Jonas Augusto Rizzato Paschoal; Rosangela Gonçalves Peccinini

• Orientador: Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira

Resumo

A piplartina (PPT) ou piperlongumine é um produto natural da classe dos alcaloides encontrada em espécies da família Pipereaceae. Devido a sua alta potência e seletividade na inibição de diversas linhagens de células tumorais, a PPT têm sido investigada como um potencial candidato à fármaco. Neste contexto, estudos relacionados à sua toxicidade e segurança devem ser realizados, incluindo a determinação do papel das enzimas do Citocromo P450 (CYP450) sobre o metabolismo da PPT. Esta família de enzimas é responsável pela biotransformação de cerca de 75% dos fármacos presentes no mercado. Os estudos pré-clínicos que visam avaliar o metabolismo podem ser realizados empregando modelos in vitro como uma ferramenta para predição de características farmacocinéticas in vivo. Assim, o presente estudo teve como objetivo a avaliação do perfil metabólico da PPT frente as enzimas do CYP450 empregando-se estudos in vitro com microssomas hepáticos humanos (HLM) e a posterior predição de parâmetros farmacocinéticos. Estes estudos incluíram a determinação de parâmetros enzimáticos, estudos de inibição da PPT sobre as principais isoformas do CYP450, elucidação estrutural de metabólitos gerados com a reação de metabolismo e, finalmente, estudos de fenotipagem enzimática. A metodologia geral de estudo de metabolismo in vitro envolveu o uso de técnicas cromatográficas acopladas a diversos detectores/analisadores, tais como arranjo de diodos, espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear. O metabolismo foi avaliado pela medida da taxa de desaparecimento da PPT do meio microssomal. Após validação da metodologia para quantificação da PPT e determinação das condições de velocidade inicial de reação, um perfil sigmoidal foi obtido, indicando o metabolismo da PPT por enzimas contendo múltiplos sítios ativos e/ou catálise por diversas enzimas concomitantemente. Os parâmetros cinéticos calculados foram Vmax = 5,5 ± 0,5 nmol mg proteína-1 min-1, S50 = 127,70 ?mol L-1 e Coeficiente de Hill (h) = 3. O clearance intrínseco obtido foi de 22,68 ?L min -1 mg -1. A fração não ligada às proteínas plasmáticas e microssomais foi de 0,07 e 0,76, respectivamente. O clearance in vivo predito foi de 19,79 mL min -1 kg -1, o clearance hepático de 1,89 mL min -1 kg -1 e extração hepática de 0,09. Dentre quatro isoformas avaliadas, CYP3A, CYP2C9, CYP2D6 e CYP1A2, a PPT demonstrou um potencial em causar interação produto natural-medicamento apenas sobre a CYP1A2. A PPT é um inibidor competitivo dose-dependente da CYP1A2, apresentando um valor de Ki de 1,5 ?mol L-1. A razão [I]/Ki obtida de 9,1 prediz uma interação relevante in vivo. Além disso, a PPT apresentou uma inibição tempo-dependente sobre a CYP1A2 com valores de KI de 8 ?mol L-1 e kinact de 0,014 min-1. A inibição dose-, ii NADPH- e tempo-dependente confirmam uma inibição baseada no mecanismo em que o modo pelo qual a PPT liga-se à enzima é irreversível. Baseado nos dados obtidos pelas análises por espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear, quatro metabólitos gerados após metabolismo da PPT com HLM tiveram suas estruturas propostas. Assim, foram caracterizados os metabólitos M1 (produto de uma desmetilação na posição meta do anel 3,4,5-trimetoxicinâmico), M2 (produzido por uma epoxidação entre o C3 e C4 do anel lactâmico), M3 (gerado através de uma oxidação no C5 do anel lactâmico) e, finalmente, M4 (produto de uma reação transdiidrodiol entre C3 e C4). O metabólito M4 é formado tardiamente (após 40 min de reação) e provavelmente é um metabólito secundário produzido a partir de M2 através de uma reação trans-diidrodiol. O estudo de fenotipagem demonstrou que as principais isoformas que contribuem para o metabolismo da PPT são a CYP1A2 (formação de M1) e a CYP3A4 (formação de M2 e M3). O emprego das isoformas recombinantes demonstrou a formação de M4 a partir da catálise por diversas isoformas, CYP2C19, CYP2C8, CYP2D6, CYP2B6 e CYP2E1. Portanto, o perfil metabólico do candidato a agente antitumoral PPT frente às enzimas do CYP450 foi demonstrado neste trabalho, proporcionando aspectos relacionados à segurança e eficácia desta substância. Os dados apresentados certamente servirão como guia em estudos clínicos futuros (AU)

• Processo FAPESP: 13/04188-4 - Estudo de metabolismo in vitro e inibição enzimática do produto natural piplartina empregando microssomas e superssomas hepático humano
• Beneficiário: Fernanda de Lima Moreira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado