Avanços na produção e formulação de blastosporos de Metarhizium e estudos do transcriptoma da fase de crescimento leveduriforme e filamentosa

Autor(es)

Natasha Sant'Anna Iwanicki

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Piracicaba.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALA/BC)
• Data de defesa: 2020-03-31

Membros da banca

Gilberto José de Moraes; Gilberto Ubida Leite Braga; Tariq Mahmud Butt; Nicolai Vitt Meyling; Claudia Barros Monteiro Vitorello

• Orientador: Italo Delalibera Junior

Resumo

O controle biológico de pragas é um mercado crescente no mundo. Espera-se que o uso de fungos entomopatogênicos no controle de pragas ocupe uma parcela importante desse mercado nos próximos anos. A maioria dos produtos à base de fungos no mundo é composta por conídios aéreos produzidos por fermentação sólida com grãos de cereais. Uma alternativa aos conídios aéreos é o uso de blastosporos, células hidrofílicas semelhantes a leveduras. Estas células podem ser produzidas em grandes quantidades por fermentação líquida em curto tempo (<4 dias), em um espaço pequeno e com pouco trabalho manual em comparação com o método de fermentação sólida. Portanto, os principais objetivos dos presente estudo foram: primeiro: otimizar um meio de cultura líquido, de baixo custo, para a produção de blastoporos de Metarhizium; segundo: avaliar a bioatividade dos blastosporos secos por secagem lenta contra o carrapato-do-boi Rhipicephalus microplus; terceiro: desenvolver uma formulação pó-molhável de blastosporos de Metarhizium com bioatividade contra a cigarrinha do milho Dalbulus maidis; quarto: buscar o incremento do tempo de prateleira das melhores formulações secadas pelos métodos de secagem lenta e spray-dryer, com adição de absorventes de oxigênio e umidade nas embalagens ou a vácuo e armazenadas em geladeira (± 4 °C) e em condições de ambiente (28°C); quinto: determinar in vitro as alterações na expressão gênica entre as fases de crescimento filamentoso e leveduriforme (blastosporo) que possam estar associadas às principais alterações fisiológicas e metabolismos do dimorfismo de M. anisopliae e M. rileyi. Mostramos que a produção de blastosporos de Metarhizium varia entre isolados e espécies. As culturas enriquecidas com glicose e inoculadas com pré-culturas melhoraram a produção de Metarhizium robertsii ESALQ1426 (5.9 x 108 blastospores /mL) em apenas 2 d. Os blastosporos de ESALQ1426 obtidos por secagem lenta mataram larvas de R. microplus com uma eficiência comparável a conídios aéreos. Tanto a pressão osmótica, induzida por altos teores de glicose, quanto a seleção de isolados se mostraram ser fatores críticos para produção de altos rendimentos de blastosporos de Metarhizium, que por sua vez, são infectivos a larvas de R. microplus. Os experimentos de cinética de crescimento de blastosporos e otimização da fonte de nitrogênio resultaram na definição de um meio de baixo custo usando milhocina (80 g/L) como fonte de nitrogênio atingindo rendimentos de 4.7 x 108 para ESALQ1426 em apenas 2 dias de cultivo a um custo de apenas US$ 0,30/L. Os blastosporos/mL. para ESALQ1426 em apenas 2 dias de cultivo a um custo de apenas US$ 0,30/L. Os blastosporos obtidos por secagem lenta foram tão virulentos quanto blastosporos frescos para adultos de D. maidis mantidos em plantas de milho. Co-formulantes foram selecionados para compor formulações que preservassem a viabilidade dos blastosporos de ESALQ1426 durante o processo de secagem. As formulações de blastosporos secos por secagem lenta e spray-dryer foram tão virulentas quanto os blastosporos frescos para a cigarrinha do milho, induzindo taxas de mortalidade variando de 60,3 a 78,2% após a pulverização com 5 x 107 blastospores/mL. O LC50 foi significativamente maior para a formulação obtida por secagem lenta (2.42 x 107) do que para a formulação obtida em spray-dryer (4.65 x 106), sugerindo um possível efeito prejudicial da tecnologia anterior na virulência dos fungos. O transcriptoma de M. anisopliae revelou uma clara distinção na expressão gênica entre as fases leveduriforme e micelial. Os principais processos fisiológicos regulados nos blastosporos durante a fermentação líquida foram estresse oxidativo, metabolismo de aminoácidos, processos respiratórios, transporte transmembranar e produção de metabólitos secundários. Por outro lado, os principais processos fisiológicos regulados nas hifas estavam associados ao crescimento e a reorganização da parede celular. Esses resultados destacam as principais funções metabólicas relacionadas a morfologia de crescimento dos blastosporos e hifas de M. anisopliae, respectivamente. Por outro lado, observou-se que células leveduriformes (blastosporos) de M. rileyi produzidas em meio líquido ativaram uma série de genes específicos relacionados à transdução de sinal e transportadores de membrana relacionados à aquisição de ferro, o que não foi observado nas hifas. O estresse oxidativo e a ativação de proteínas específicas \"heat shock protein\" foram fatores- chave envolvidos na formação de células leveduriformes. Por outro lado, a fase leveduriforme cultivada em meio sólido ativa um conjunto de genes únicos, não encontrados em outras espécies de Metarhizium, como proteínas específicas da membrana e vários fatores de virulência. Esses estudos demonstraram claras diferenças entre o metabolismo dos blastosporos e das hifas. Esses achados ilustram aspectos importantes da morfogênese em M. anisopliae Esses achados ilustram aspectos importantes da morfogênese em M. anisopliae e destacam as principais atividades metabólicas de cada propágulo sob condições de crescimento in vitro. Os estudos de transcriptoma estabeleceram as bases para a compreensão do metabolismo necessário para o crescimento de blastosporos em meio líquido e identificaram genes candidatos que servirão de base para futuras pesquisas sobre a otimização da produção de blastosporos de M. rileyi. (AU)

• Processo FAPESP: 16/20610-6 - AVANÇOS NA PRODUÇÃO E FORMULAÇÃO DE BLASTOSPOROS DE Metarhizium E TRANSCRIPTOMA DA FASE DE CRESCIMENTO LEVIDURIFORME
• Beneficiário: Natasha Sant Anna Iwanicki
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado