Purificação e caracterização de enterohemolisina produzida por Escherichia coli enteropatogenicas

Autor(es)

Cleide Ferreira Catani

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 1999-07-30

Membros da banca

Tomomasa Yano; Marisa Sumiko Arita Matsuura; Jose Camillo Novello; Domingos da Silva Leite; Antonio Jose Piantino Ferreira

• Orientador: Tomomasa Yano

Resumo

As enterohemolisinas (EHly) foram inicialmente detectadas em amostras de Escherichia co/i enteropatogênicas clássicas (EPEC), isoladas a partir de fezes de crianças com diarréia, sendo posteriormente detectada em amostras de E. co/i isoladas de animais. Esta hemolisina, diferentemente da a-hemolisina, não é liberada espontaneamente no meio de cultivo, sendo necessária sua extração da célula bacteriana. Entre os métodos de extração utilizados, a sonicação mostrou ser o método mais eficiente para a liberação da enterohemolisina. Para a detecção da atividade hemolítica, os diferentes materiais a serem testados foram incubados a 37°C por lh, em microplacas ou em tubos, com 1% de eritrócitos de carneiro lavados com tampão PBS. A amostra padrão de E. co/i C3888 foi utilizada para a produção e purificação da enterohemolisina. Esta cultura foi cultivada em meio TSB, acrescido de quelante de ferro EDDA, por 22 horas em shaker a 37°C. Após o cultivo, a cultura foi sonicada e precipitada com sulfato de amônio com 60% de saturação. O material precipitado foi cromatografado em coluna de DEAE FastFlow. As frações com atividade hemolítica foram recromatografadas em coluna de exclusão molecular Superdex 200 e posteriormente em coluna Mono Q no sistema HPLC. A fração com atividade hemolítica obtida da coluna Mono Q apresentou apenas uma banda de 60kDa em gel de SDS-P AGE. No processo de purificação foi obtido um aumento na atividade específica de 2800 vezes, e aproximadamente 100 vezes na atividade relativa. A atividade da EHly se manteve estável por diversos meses no sonicado de cultura, quando este foi mantido a baixas temperaturas (-20°C e -70°C). Entretanto, não foi possível manter a atividade da hemolisina pura nos processos finais de purificação. Apesar da utilização de três diferentes métodos de inoculação em coelhos, para a obtenção de antissoro específico anti-enterohemolisina, não foram obtidos resultados satisfatórios nos testes de neutralização realizados, já que os títulos de soroneutralização obtidos foram os mesmos com soros pré e pós-imunização. Em testes com diferentes culturas celulares, a enterohemolisina semi-purificada foi citotóxica para as culturas de células Hep-2, HeLa, Caco-2, Vero, MDBK e 3T3, com arredondamento celular e descolamento do tapete. As células CHO apresentaram um efeito citopático, com alongamento das células e aparente condensação do núcleo. Nos ensaios com camundongos, não foi observado letalidade ou toxicidade nos animais adultos ou nos recém-nascidos testados (AU)

• Processo FAPESP: 95/01439-6 - Purificação e caracterização de enterohemolisina produzida por Escherichia coli enteropatogênicas
• Beneficiário: Cleide Ferreira Catani
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado