Efeitos de diferentes tensões de oxigênio na eficiência da reprogramação e manutenção de células-tronco pluripotentes induzidas de equino

Autor(es)

Raquel Vasconcelos Guimarães de Castro

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Jaboticabal. 2020-09-11.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. Jaboticabal
• Data de defesa: 2020-07-15
• Orientador: Joaquim Mansano Garcia; Fabiana Fernandes Bressan

Resumo

Células tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são uma ferramenta promissora para o tratamento de doenças, seja através de seu uso na medicina regenerativa, com estudos clínicos in vitro, ou ainda em estudos na área básica para desvendar mecanismos fisiológicos e patológicos. No entanto, algumas limitações, como a idade avançada do doador, o estado de senescência celular ou até mesmo as condições da atmosfera gasosa utilizadas no cultivo in vitro podem diminuir a eficiência da reprogramação à pluripotência. Dessa forma, a presente tese teve como objetivo estudar os efeitos do oxigênio no cultivo de células iPSC de equino (eiPSC), sendo na reprogramação à pluripotência ou nas iPSC originadas. No capítulo 1 uma revisão de literatura foi realizada a fim de sustentar a hipótese e justificar o estudo. No capítulo 2, o efeito das diferentes tensões de oxigênio (tensão de oxigênio atmosférica – aproximadamente 20% O2; tensão de oxigênio reduzida - 5% O2; ou a mudanças da atmosfera gasosa de aproximadamente 20% O2 para 5% O2) foi estudado durante o processo de reprogramação celular à pluripotência. Para tanto, a eficiência de reprogramação em cada grupo foi considerada, e uma avaliação seriada, a cada 3 dias, da expressão de genes chave de pluripotência (OCT4, SOX2, REX-1 e NANOG), genes relacionados ao metabolismo da glicose (GAPDH, e PFKM), genes relacionados aos processos de fusão e fissão mitocondriais (MFN1 e DNM1L), e genes relacionados a resposta da célula à baixa tensão de oxigênio (HIF1α, HIF2α, e VEGFA), foram realizadas, através de uma análise descritiva. A eficiência de reprogramação encontrada foi maior para o grupo cultivado em baixo oxigênio (grupo B). A alta eficiência de reprogramação do grupo B teve aparente correlação com uma maior expressão de OCT4 e NANOG e menor expressão de MFN1. Por outro lado, os resultados encontrados para o GAPDH sugeriram uma correlação negativa com a eficiência de reprogramação, e os genes HIF1α e HIF2α apresentaram expressão com menores valores no grupo B do que nos demais. Os resultados encontrados comprovam a hipótese de que a tensão de oxigênio influenciou na reprogramação das células eiPSC, já que observamos mudanças na expressão gênica entre os grupos ao longo da reprogramação. Além disso, a eficiência de formação de colônias eiPSC em baixo oxigênio foi maior que em alto oxigênio. No capítulo 3, eiPSC de um animal de mais de 20 anos de idade foram obtidas e o efeito das mesmas diferentes tensões de oxigênio propostas no capítulo 2 foi estudado nessas células. A reprogramação das células do animal idoso foi possível, como demonstrado pela coloração positiva para fosfatase alcalina; expressão endógena de mRNA de genes relacionados à pluripotência (OCT4, SOX2, REX-1 e NANOG) em todas as colônias avaliadas; coloração positiva no ensaio de imunofluorescência para OCT4 e NANOG (todos os grupos), SOX2 (grupo 5% O2 e 20% para 5% O2) e TRA-1-60, TRA-1-81 e SSEA-1 (somente em 20% O2), demonstrando diferenças entre os grupos; a formação de corpos embrióides; e diferenciação celular espontânea nas três camadas germinativas embrionárias mesoderme, endoderme e ectoderme. Diferenças na morfologia das colônias de eiPSC geradas foram observadas, sendo que as células do grupo cultivado em 20% O2 apresentaram maior similaridade com células “naïve” e as células dos grupos cultivados em 5% O2 e 20% para 5% O2 maior similaridade com a morfologia de células “primed”. Diferenças significativas foram também observadas na expressão dos genes GAPDH, GLUT3, MFN1, HIF1α e HIF2α, relacionados ao metabolismo da glicose, fissão mitocondrial, e hipóxia, respectivamente, após a reprogramação. Nossos resultados demonstram que a derivação de eiPSC não foi prejudicada pela idade avançada do animal. Além disso, esse estudo é o primeiro a comparar o cultivo de iPSC de equino em alto e baixo oxigênio e a demonstrar que o oxigênio influencia no processo de reprogramação nesses animais, como indicado pela geração de células pluripotentes com diferentes perfis; nas condições testadas, a tensão de oxigênio mais baixa foi responsável por uma maior eficiência de reprogramação, em acordo com o demonstrado no capítulo 2, mas não favoreceu a pluripotência das eiPSC. (AU)

• Processo FAPESP: 18/04009-6 - Efeitos de baixa tensão de oxigênio na eficiência da reprogramação e manutenção de células-tronco pluripotentes induzidas de equino
• Beneficiário: Raquel Vasconcelos Guimarães de Castro
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado