Caracterização molecular do metabolismo de fontes de carbono durante o desenvolvimento da interação fitopatogênica vassoura-de-bruxa em cacau

Autor(es)

Joan Grande Barau

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2011-08-26

Membros da banca

Gonçalo Amarante Guimarães Pereira; Marisa Vieira de Queiroz; Antonio Rossi Filho; Fabio Papes; Marcelo Menossi

• Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira; Johana Rincones

Resumo

A introdução da doença vassoura de bruxa do cacaueiro no Sul da Bahia representa um dos maiores exemplos da magnitude de impacto sócio econômico que uma fitopatologia pode aflingir a uma região ou país com um predominante perfil agroexportador. Com a execução do projeto genoma do fungo causador da vassoura de bruxa, o Basidiomiceto Moniliopthora perniciosa, uma série de trabalhos de caracterização morfológica, fisiológica e genética da doença foram inciados. Em um primeiro momento, em paralelo com a caracterização das alterações bioquímicas da doença, buscamos entender as diferenças de expressão gênica através de microarranjos de DNA e bibliotecas ESTs comparando as duas fases morfo-genéticas do fungo reproduzidas in vitro. Apesar de esse esforço pioneiro ter permitido a formação de um modelo panorâmico das alterações genéticas do fungo e fornecido importantes diretrizes para a pesquisa futura, ficou claro a necessidade de se explorar em maior detalhe a interação in vivo. Dentre os aspectos importantes investigados, o estudo do metabolismo do glicerol durante a fase biotrófica da interação através de marcadores de expressão mostrou que essa fonte de carbono em potencial pode ter um papel importante no início da infecção e participar da sinalização de stress através da modulação do shuttle mitocondrial de glicerol 3-fosfato. No entanto, a necessidade de se entender melhor o panorama das fontes de carbono disponíveis no apoplasto, o microambiente ocupado pelo fungo nas fases iniciais da interação, nos motivou a caracterizar as alterações nutricionais desse espaço ao longo da doença. Foi possível demonstrar que a vassoura de bruxa quebra o ciclo de carbono normal do apoplasto e que induz o corte da comunicação vascular com as partes sadias da planta ao final da fase biotrófica. Uma correlação entre a sinalização por carbono e a expressão de genes de patogenicidade secundária foi explorada. Com a expansão dos dados de genoma e transcriptoma utilizando sequenciamento de DNA de terceira geração (Illumina e 454 Life Sciences), dezenas de genes-alvo com potencial participação em vias de patogenicidade e desenvolvimento da doença foram identificados. Nesse contexto, dentre as ferramentas para análises de genômica funcional nesse modelo, a inativação ou nocaute de genes por gene targeting e o estudo da atividade de proteínas através de fusões com genes repórteres são essenciais ao teste das hipóteses geradas como fruto da pesquisa genômica da Vassoura-de-bruxa. Transformantes de M. perniciosa carregando uma cópia do gene marcador de autofagia MpATG8 fusionado ao marcador GFP apresentaram um padrão de fluorescência característico da biologia celular de ATG8, permitindo acompanhar o processo de autofagia sob condições de deprivação de nutrientes, demonstrando a possibilidade da aplicação de fusões com repórteres fluorescentes para experimentos de localização subcelular de proteínas desse fitopatógeno. Por fim, uma estratégia baseada na seleção de recombinantes através da técnica split marker em conjunto com um silenciamento transiente do sistema de reparo NHEJ por RNAi foi traçada e executada de modo a obter o nocaute do gene MpKu70, essencial a essa via de reparo, cuja inativação está associada a um aumento da eficiência de recombinação homóloga e gene targeting (AU)

• Processo FAPESP: 06/56942-0 - Caracterização molecular do metabolismo do glicerol durante a interação patogênica planta fungo no desenvolvimento da doença Vassoura-de-Bruxa em cacau
• Beneficiário: Joan Grande Barau
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto