Septinas e proteases flavivirais: uma análise estrutural

Autor(es)

Higor Vinícius Dias Rosa

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: São Carlos.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Física de São Carlos (IFSC/BT)
• Data de defesa: 2022-03-25

Membros da banca

Richard Charles Garratt; Shaker Chuck Farah; Jörg Kobarg

• Orientador: Richard Charles Garratt; Ana Paula Ulian de Araujo

Resumo

Em 2016, um aumento de 26 vezes nos casos de microcefalia durante uma epidemia do vírus Zika alarmou o país. Nesses casos, durante a infecção, o vírus tem como alvo principal as células progenitoras neuronais (NPCs), diminuindo a sua proliferação levando à morte celular, que contribui para microcefalia. Ao identificar o efeito isolado de proteínas virais sobre essas células, Li et al. (2019) observaram que a protease NS2B-NS3 é capaz de mediar a neurotoxicidade do vírus, por meio da clivagem de proteínas do hospedeiro essenciais à neurogênese (em especial as septinas). Verificou-se uma redução nos níveis dessas proteínas após a superexpressão da protease, confirmando-as como alvo. No mesmo estudo, os efeitos citotóxicos foram relacionados à clivagem do C-terminal da septina 2, resgatando a citocinese após expressão de septinas 2 \"resistentes\" à clivagem. Apesar dos efeitos celulares (após a clivagem) terem sido determinados, o efeito imediato e a importância da região clivada na formação das estruturas de septinas ainda estava obscuro. Também não era entendido, se a clivagem de septinas era específica de Zika ou se outras proteases de flavivírus poderiam clivá-las. Assim, foram utilizadas construções truncadas de septinas para a montagem de heterocomplexos a fim de caracterizá-los e avaliar potenciais de polimerização. Foram realizados, também, ensaios da atividade proteolítica e análises da interação envolvendo septinas e diferentes proteases de flavivírus. A partir desses estudos, verificou-se que os complexos hexaméricos ainda conseguem ser formados na ausência desses C-terminais, apesar destes influenciarem na estabilidade. Contudo, quando analisada a capacidade de formação de filamentos, pode-se verificar que a ausência desses domínios influencia não só na morfologia dos filamentos formados, como também na concentração necessária para o aparecimento dessas estruturas de alta ordem. Mais especificamente o C-terminal da SEPT2 clivado pela protease de ZIKV, se mostrou crítico para a observação de filamentos em concentrações fisiológicas, justificando assim os efeitos posteriores causados em decorrência de sua clivagem. Paralelamente, observou-se uma especificidade da protease do ZIKV na clivagem de septinas, quando comparado ao YFV. As explicações dadas para uma maior eficiência dessa clivagem off-target são: maior correspondência entre a sequência da região de clivagem na SEPT2 e a sequência preferidas para clivagem ZIKV, quando comparada ao YFV, e maior eficiência catalítica intrínseca da protease de ZIKV vs. YFV. Para esse último ponto, pode-se verificar que as duas proteases apresentam diferenças nos perfis de oligomerização em solução, o que (aliado a outros fatores) poderia ter algum efeito no aumento dessa atividade catalítica. Finalmente, a partir da análise da interação de septinas com proteases inativas, pode-se verificar que a clivagem ocorre de modo transiente e um complexo estável entre essas proteínas não pode ser obtido. Um peptídeo representando a sequência da região de clivagem da SEPT2 foi sintetizado e ensaios preliminares de co-cristalização foram feitos. Uma possível estrutura desse complexo seria muito interessante para o entendimento do processo de clivagem e desenvolvimento de fármacos contra a microcefalia. Esperamos que todos esses resultados ajudem a entender as implicações da clivagem da septina 2 e a relação com a microcefalia. (AU)

• Processo FAPESP: 19/22000-9 - Septinas e proteases de flavivirus: uma análise estrutural
• Beneficiário: Higor Vinícius Dias Rosa
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado