Texto completo
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| Autor(es): |
João Victor Batalha de Carvalho
Número total de Autores: 1
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| Tipo de documento: | Tese de Doutorado |
| Imprenta: | São Paulo. |
| Instituição: | Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Ciências Biomédicas (ICB/SDI) |
| Data de defesa: | 2022-11-29 |
| Membros da banca: |
Ana Maria Moro;
Denise Morais da Fonseca;
Keity Souza Santos;
Aryene Góes Trezena
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| Orientador: | Ana Maria Moro |
| Resumo | |
O CD3 é um conjunto de cadeias proteicas não-covalentemente associadas às cadeias do receptor das células T (TCR). O complexo CD3 é essencial para a ativação dos linfócitos T e até para a correta expressão do seu TCR na superfície celular. O complexo TCR-CD3 é alvo de várias imunoterapias focadas na regulação da atividade dessas células. Anticorpos monoclonais (mAbs) anti-CD3 possuem grande potencial no tratamento de doenças autoimunes (diabetes mellitus I, doenças inflamatórias do intestino), na indução de tolerância em transplantes alogênicos e na imunoterapia oncológica (anticorpos bi-específicos). O mAb anti-CD3 produzido por hibridoma murino possui limitações de uso terapêutico pela indução de reações adversas como proliferação de células T e secreção de citocinas pró-inflamatórias. Para evitar problemas associados à imunogenicidade das moléculas não-humanas, alguns mAbs anti-CD3 passaram por humanização. como o Otelixizumab, Visilizumab, Teplizumab. O uso experimental de mAbs anti-CD3 humanizados tem sido associado a um aumento de linfócitos T reguladores (Treg) e de citocinas relacionadas com um perfil imunorregulador. Para testar o potencial imunorregulador de um anti-CD3 humanizado a partir de um hibridoma reclonado no Instituto Butantan, este trabalho propõe a avaliação da atividade imunorreguladora induzida por mAbs anti-CD3 humanizados através de ensaios in vitro. Os genes das cadeias leve e pesada da molécula humanizada in silico foram clonados em vetor pCHO e transfectados em células CHO-S. Os clones foram avaliados pela produtividade, crescimento celular e ligação ao CD3 humano. Para os ensaios de ligação por ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi expresso um antígeno humano CD3 gama-épsilon. O gene do antígeno recombinante foi construído por DNA assembly e expresso em Escherichia coli. O perfil de ligação dos anticorpos humanizados é mais baixo do que aquele visto com o anti-CD3 murino, o que indica uma menor afinidade da molécula humanizada. Dos 280 clones de anti-CD3 umanizado, foram selecionados alguns para os ensaios funcionais in vitro com PBMC humano, além do pool estável pré-clonagem. Por citometria de fluxo a taxa de proliferação de dois clones avaliados foi mais baixa do que a induzida por tratamento com o anti-CD3 murino em ambas as concentrações testadas (1 e 5 g/mL). O tratamento com o anticorpo humanizado aumentou a subpopulação de células T CD4+ e diminuiu o CD8+ em relação ao murino. A subpopulação de Treg (CD4+ CD127-CD25highFoxp3+ ) aumentou com o tratamento humanizado, ao inverso do mesmo com o anticorpo murino. O perfil de citocinas/quimiocinas (48h/192h) para o tratamento com o anti-CD3 murino foi altamente inflamatório no tempo de 48h na avaliação do sobrenadante e nos tempos de 24 e 72 h no ensaio de marcação intracelular. Os clones humanizados presentaram um perfil próximo ao controle não tratado na avaliação dessas citocinas. Entretanto, o estudo das citocinas intracelulares apresentou um aumento dos granulócitos nos grupos tratados com o anticorpo humanizado, sendo que esses grupos não apresentaram um aumento na produção de IFN-γ e TNF-α. Estes dados contribuem para a compreensão da cinética do anti-CD3 humanizado, apesar de não conclusivos. Mais estudos são necessários nas possíveis construções do anti-CD3 humanizado (monoespecíficos, biespecíficos etc.). (AU) | |
| Processo FAPESP: | 19/10724-2 - Anticorpos monoclonais recombinantes para uso terapêutico |
| Beneficiário: | João Victor Batalha de Carvalho |
| Modalidade de apoio: | Bolsas no Brasil - Doutorado Direto |