Construção e caracterização eletrofisiológica inicial de um sistema in vitro expressando o gene SCN1A selvagem e mutações associadas a Síndrome de Dravet

Autor(es)

Demetrio Saul Lindo Samanamud

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências Médicas
• Data de defesa: 2022-12-12

Membros da banca

Íscia Teresinha Lopes Cendes; Simoni Helena Avansini; Fábio Rogério; José Eduardo Peixoto Santos

• Orientador: Íscia Teresinha Lopes Cendes; Andre Schwambach Vieira

Resumo

As epilepsias são um grupo de doenças com sinais e sintomas específicos, apresentando características típicas no eletroencefalograma, e que frequentemente apresenta aspectos etiológicos próprios, tais como genéticos, estruturais, metabólicos e infeciosos. Atualmente, reconhece-se que muitos tipos de epilepsia têm fator etiológico genético, de caráter monogênico. Nesse contexto, o gene SCN1A tem importância reconhecida, tendo sido ligado a vários fenótipos de epilepsia. Tal gene codifica a subunidade-?-1do canal de sódio voltagem dependente (Nav1.1). Este canal é um complexo multiproteico, cuja função é a de regular o transporte do íon de sódio entre o meio extracelular e intracelular. Variações genéticas no gene SCN1A podem causar alterações nas propriedades biofísicas do canal de sódio, que por sua vez provocam alterações no fluxo de íons de sódio, levando à hiperexcitabilidade neuronal. Digno de nota, a maioria dos pacientes com síndrome de Dravet (SD), uma encefalopatia epiléptica e do desenvolvimento caracterizada por crises de difícil controle, associadas a graus diversos de deficiência intelectual e de retardo do desenvolvimento neuropsicomotor, apresentam mutações que ocorrem, em geral, "de novo" no gene SCN1A. De fato, estudos prévios de nosso grupo determinaram que 81% dos pacientes com SD, apresentam variantes classificadas como patogênicas ou possivelmente patogênicas no gene SCN1A, sendo que a maioria dessas são do tipo "missense" e algumas do tipo "nonsense" e "frameshift", que geram proteínas truncadas. Em geral, esses diferentes tipos de variantes ligados a doença levam a perda de função do canal de sódio, o que em última análise, determina a fisiopatologia da SD. Porém, apesar deste mecanismo em comum, observa-se grande diversidade nos fenótipos das epilepsias associadas a mutações no gene SCN1A. Esse aspecto, associado a permanente dificuldade que ainda se encontra na determinação da ligação entre variantes genéticas e o fenótipo dos pacientes, torna o diagnóstico molecular complexo. Isso acontece pois, atualmente, a determinação da associação entre a variação genética e a manifestação fenotípica da doença é determinada pela combinação de critérios que incluem: a utilização de ferramentas de predição do impacto das variantes na função proteica, frequência das variantes na população geral, e, principalmente, estudos funcionais das alterações na proteína. Este último critério é crucial na elucidação de evidências mais conclusivas sobre a determinação da patogenicidade das variantes encontradas em pacientes. No entanto, os estudos funcionais são raros e na maioria dos casos não há critério funcional para se estabelecer o diagnóstico genético. Nesse sentido, nosso trabalho teve como objetivo a realização de estudos biofísicos de três mutações que foram encontradas em pacientes com o fenótipo de SD na nossa casuística, são elas: c.5177G>A, c.5329delG, c.5434T>C que produzem as proteínas mutantes W1726X, V1777fsX1778 e W1812R, respectivamente. Para essas mutações não foi possível utilizar ferramentas de predição "in sílico" na análise de patogenicidade. Dessa forma, expressamos essas proteínas mutantes em células Hek-293T pôr não apresentar expressão endógena do canal de sodio e usamos a técnica de Patch Clamp para caracterizar as propriedades biofísicas desses canais mutantes. Nossos resultados, para os três casos estudados, mostram que a densidade de corrente diminui notavelmente em relação ao canal de sódio sem mutação, indicando perda de função em grau variado. Desse modo, concluímos que nos três casos, a variação genética presente no gene SCN1A, pode estar relacionada ao fenótipo de SD apresentado pelos pacientes. Nosso trabalho, além de levar a uma resolução do diagnóstico molecular dos pacientes em estudo e entender o efeito funcional de cada mutação, estabelece as bases para a implantação desse tipo de estudo na inferência da função do canal de sódio em nosso meio (AU)

• Processo FAPESP: 16/03896-3 - Caracterização funcional de mutações em canais de sódio associadas à epilepsia
• Beneficiário: Demetrio Saul Lindo Samanamud
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto