A expressão de um segmento estrutural do domínio cauda das miosinas Va e Vc, em células do melanoma B16, afeta a viabilidade celular

Autor(es)

Daniela Dover de Araujo

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2003-08-27

Membros da banca

Enilza Maria Espreafico; Roger Chammas; Auro Nomizo

• Orientador: Enilza Maria Espreafico

Resumo

As miosinas da classe V têm função essencial no tráfego de organelas e participam na via de transdução de sinal de cálcio, secreção, expressão de moléculas na superfície celular; transporte de mRNA e complexos proteicos e possivelmente na dinâmica do centrossomo e fuso mitótico. Com o objetivo de contribuir para uma melhor caracterização do papel de cada uma das três formas de miosina V (MV) identificadas, o presente trabalho desenvolveu a estratégia de selecionar um segmento de aproximadamente 50 aminoácidos da sequência dessas miosinas, com baixa conservação entre as mesmas, supondo que, quando expressos em células de mamíferos, poderiam interferir com funções específicas de cada um dos membros dessa classe. Os segmentos MVa1274-1328 e MVc1179-1232 foram amplificados por RT-PCR, sequenciados e clonados em vetores de expressão bacteriano (pGEX) e de mamífero (pEGFP e pDsRed). Estudos fenotípicos na linhagem de melanoma murino B16-F10 revelaram que a expressão de MVa1274-1328EGFP induz um decréscimo de 93% no número de células transfectadas no intervalo de 18 a 72 horas após a transfecção e a expressão de MVc1179-1232EGFP induz em torno de 37% de decréscimo, enquanto que o número de células controle, expressando a EGFP sozinha, aumenta em torno de 35% durante o mesmo intervalo de tempo. Células superexpressando MVa1274-1328-EGFP exibem tamanho menor que o usual, forma redonda e são facilmente liberadas do substrato. Análise do DNA e F-actina em células transfectadas com MVa1274-1328-EGFP, 20 horas após transfecção, mostrou que em torno de 70% das células transfectadas exibem cromatina condensada ou fragmentada, bem como, a disposição da F-actina em forma de anel cortical e a presença de bolhas na superfície celular, características de resposta apoptótica. Foi demonstrado que MV, através da interação com a cadeia leve de dineína (DLC2), sequestra o fator pró-apoptótico, Bmf, no citoesqueleto de actina, sendo que, danos à célula, como bloqueio de adesão, induzem a liberação deste fator que age sobre a Bcl2 desencadeando a apoptose. Demonstramos aqui, que a proteína expressa em bactéria, MVa1274-l328GST, mas não a MVc1179-1232GST, foi capaz de interagir com a DLC2 in vitro, sugerindo que o efeito da MVa1274-1328EGFP sobre a viabilidade celular em células de melanoma seja devido à competição por DLC2/Bmf liberando esse fator dos seus sítios de ancoragem. Quanto à MVc1179-1232egfp, não temos qualquer evidência dos mecanismos subjacentes que expliquem seu efeito, seja sobre a morte ou proliferação celular. Nesse trabalho, verificamos também que a MVa apresenta expressão e localização diferencial em três linhagens de melanoma humano dos estágios radial, vertical e metastático da progressão tumoral. Os dados apresentados reforçam as evidências do envolvimento da MVa em apoptose, a qual funciona como barreira para a transformação maligna. Além disso, esse trabalho identifica uma nova ferramenta que afeta a viabilidade celular, podendo servir como sonda para investigar a função das MV na resposta apoptótica em diversos tipos celulares e ainda como um potencial reagente para interferência no crescimento tumoral. (AU)

• Processo FAPESP: 01/12831-7 - Caracterizacao dos efeitos da superexpressao de um segmento estrutural da cauda das miosinas va e vc sobre a apoptose.
• Beneficiário: Daniela Dover de Araujo
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado