Estudo do papel das RNA helicases da família DEAD-box RhlB e RhlE na estabilidade de RNAs e na expressão gênica em Caulobacter crescentus

Autor(es)

Hugo Libonati de Araujo

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Ciências Biomédicas (ICB/SDI)
• Data de defesa: 2023-02-02

Membros da banca

Marilis do Valle Marques; Andrea Balan Fernandes; Rogerio Ferreira Lourenço; Carla Columbano de Oliveira

• Orientador: Marilis do Valle Marques

Resumo

Caulobacter crescentus é uma alfaproteobactéria ambiental que apresenta um ciclo celular complexo, o que a torna um excelente modelo para o estudo de regulação gênica neste grupo. O estresse térmico causado por quedas de temperaturas gera uma resposta adaptativa conhecida como Reposta ao Choque-Frio, caracterizada por alterações em diversos componentes celulares e vias metabólicas. Uma dessas alterações é a tendência das moléculas de RNA de formarem estruturas secundárias estáveis, dificultando sua tradução e degradação. As RNA helicases da família DEAD-box são proteínas com a capacidade de remodelar estruturas de RNA e complexos de RNA-proteína. O objetivo deste trabalho foi definir os papéis fisiológicos das RNA helicases DEAD-box RhlB e RhlE em C. crescentus, particularmente em baixa temperatura, bem como investigar a interação de RhlB com o degradossomo de RNA. Ensaios de crescimento em baixa temperatura e na recuperação do congelamento foram realizados, bem como a identificação dos genes diferencialmente expressos no choque-frio e nas linhagens mutantes rhlB e rhlE sob diferentes temperaturas de crescimento. Foi avaliada também a interação de RhlE com o ribossomo, e linhagens contendo FLAG-RhlB com diferentes extensões da região C-terminal foram utilizadas para determinar os seus RNAs ligantes e para o mapeamento dos sítios de interação com o degradossomo. Os resultados de sequenciamento de RNA nos permitiram caracterizar a resposta de C. crescentus ao choque-frio, mostrando importantes alterações em vias do metabolismo de ferro, sistemas de transporte e detoxificação e homeostase de cátions. Foi observado que RhlE e Rho parecem participar da regulação do operon kdp em baixa temperatura por meio de estabilização do mensageiro e/ou por uma possível atenuação de transcrição. Apesar de não conseguir concluir o efeito de RhlE sobre a expressão gênica de C. crescentus, a análise do transcritoma do mutante rhlE indicou a manutenção da resposta ao frio observada na linhagem selvagem, e os experimentos de associação com o ribossomo mostraram dados inconclusivos. O mutante rhlB apresentou uma menor expressão na maioria dos genes identificados pelo sequenciamento, com um aumento considerável do número de genes após o choque-frio. Dentre estes, as principais categorias afetadas foram de transporte e metabolismo de ions inorgânicos, tradução, estrutura e biogênese ribossomal, e modificações pós-traducionais. Também foi observada uma queda considerável da viabilidade na recuperação do congelamento após incubação no frio no mutante rhlB, provavelmente por um defeito na montagem de uma resposta crioprotetora eficiente. A deleção da região C-terminal completa de RhlB gera um fenótipo de recuperação do congelamento pior que uma deleção parcial, indicando uma falta de interação com a RNase E e/ou uma possível redução da sua atividade de helicase. (AU)

• Processo FAPESP: 18/17309-8 - Estudo do papel da RNA helicase RhlB da família DEAD-box na estabilidade dos RNAs e na expressão gênica em Caulobacter crescentus
• Beneficiário: Hugo Libonati de Araújo
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado