Desenvolvimento de métodos espectrométricos (UHPLC-MS/MS e MS/MS) para a determinação de peptídeos β-amilóides em amostras de líquido cefalorraquidiano de pacientes com a doença de Alzheimer

Autor(es)

Caroline Fernandes Grecco

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2023-09-01

Membros da banca

Maria Eugenia Queiroz Nassur; Eduardo Costa de Figueiredo; Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira; Jonas Augusto Rizzato Paschoal

• Orientador: Maria Eugenia Queiroz Nassur

Resumo

A Doença de Alzheimer (DA) é uma demência neurodegenerativa progressiva que afeta cerca de 50 milhões de pessoas ao redor do mundo. A DA é caracterizada patologicamente pela presença de placas senis e de novelos neuro fibrilares no cérebro, causadas pelo acúmulo extracelular dos peptídeos β-amilóides (Aβ) e da proteína tau, respectivamente. O diagnóstico conclusivo da DA tem sido eminentemente clínico e, nesses casos, a neurodegeneração já se instalou no cérebro do paciente. Portanto, esforços têm sido realizados para encontrar um biomarcador molecular para a identificação de pacientes em risco de desenvolver a DA, bem como para o diagnóstico precoce e acompanhamento da progressão das neurodegenerações. Neste projeto, os métodos empregando as técnicas de microextração em fase sólida no capilar (in-tube Solid Phase Microextraction, in-tube SPME) associada à cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (Ultra High Performance Liquid Chromatography - tandem Mass Spectrometry, UHPLC-MS/MS) e a microextração em ponteiras descartáveis (Disposable Pipette Extraction, DPX) associada à MS/MS foram desenvolvidos e validados para a determinação de peptídeos Aβ em amostras líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com a DA. Durante o desenvolvimento do método in-tube SPME UHPLC-MS/MS, diferentes colunas cromatográficas e composições de fases móveis foram avaliadas. A coluna cromatográfica em fase reversa Acquity UPLC Peptide BEH C18 (150 mm × 2.1 mm e 1,7 µm) com a fase móvel constituída de (A) água + 0,3% hidróxido de amônio e (B) acetonitrila e temperatura de 35°C apresentou picos simétricos e menor tempo de análise. Uma fase monolítica orgânica com grupos sulfônicos foi sintetizada no interior do capilar de sílica fundida (6 cm × 530 µm d.i.) como fase extratora para a técnica intube SPME e caracterizada através das técnicas microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia vibracional da região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). As condições otimizadas para a síntese da fase monolítica foram: 1- propanol (0,65 mL) e água (0,52 mL) como solventes porogênicos; 3-sulfopropil metacrilato de potássio (SPM) como monômero funcional (0,3306 g); etileno glicol dimetacrilato (EDMA) como agente reticulante (0,2 mL); 2,2\'-azobisisobutironitrilo (AIBN) como iniciador radicalar (0,016 g); e polimerização por 24 horas à 60°C. As variáveis in-tube SPME (pH e volume de amostra, solvente e volume para a limpeza da fase e solvente e volume para a eluição dos analitos) foram avaliadas e otimizadas. O método in-tube SPME UHPLC-MS/MS apresentou linearidade adequada com concentrações que variaram do LIQ - 10 ng mL-1 com coeficientes de determinação (R2 ) maiores que 0,99. Os valores de exatidão (EPR) e precisão (CV) variaram de -11,7 a 14,3% e 1,0 a 18,9%, respectivamente. O método in-tube SPME UHPLC-MS/MS foi aplicado na determinação de peptídeos Aβ, em seis amostras de LCR de pacientes com a Doença de Alzheimer. O método DPX MS/MS utilizou ponteiras DPX (1 mL) contendo 60 mg de fase comercial Oasis MCX®, conectadas a uma seringa de polipropileno. A otimização das variáveis DPX (pH da amostra, tempo de equilíbrio de sorção, volume de amostra/número de ciclos e solução de eluição/número de ciclos) favoreceu a sensibilidade e seletividade do método e o emprego de pequenos volumes de amostra biológica e de solventes orgânicos. 5 µL do extrato final evaporado e reconstituído em 50 µL de fase móvel foram injetados no sistema MS/MS com a fase móvel constituída de (A) água contendo 0,3% hidróxido de amônio e (B) acetonitrila, com vazão de 0,05 mL min-1 ; e infusão direta de uma solução de metanol contendo 10% de hidróxido de amônio concentrado para favorecer a detectabilidade. O método DPX MS/MS apresentou linearidade adequada com concentrações que variaram do LIQ - 1,5 ng mL-1 com coeficientes de determinação (R2) maiores que 0,99. Os valores de exatidão (EPR) e de precisão (CV) variaram de -13,6 a 13,2 e 0,3 a 12,7%, respectivamente. Portanto, segundo os parâmetros de validação analítica avaliados, o método DPX MS/MS poderá ser empregado para a determinação de peptídeos Aβ em amostras de LCR de pacientes com DA. (AU)

• Processo FAPESP: 19/04386-7 - Desenvolvimento de fase monolítica orgânica para determinação de peptídeos b-amilóide AB40 e AB42 em amostras de plasma de pacientes com a Doença de Alzheimer por UHPLC-MS/MS no modo column switching
• Beneficiário: Caroline Fernandes Grecco
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado