Caracterização de efeitos funcionais de mutações pontuais na NEK1 detectadas em esclerose lateral amiotrófica sobre mitocôndrias e resposta a danos de DNA

Autor(es)

Luidy Kasuo Issayama

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas
• Data de defesa: 2023-08-17

Membros da banca

Jörg Kobarg; Nadja Cristhina de Souza Pinto; Guido Lenz; Katlin Brauer Massirer; Daniel Fábio Kawano

• Orientador: Jörg Kobarg

Resumo

As NEKs são proteínas que desempenham diversos papéis biológicos nas células. Assim como seus ortólogos, a proteína NIMA, são também responsáveis pela entrada da célula em divisão celular, porém apresentam outros papéis biológicos específicos para cada. Em seres humanos, existem 11 membros descritos que se diferenciam majoritariamente através de seu domínio regulatório e compartilham uma grande homologia em seu domínio catalítico, o que provavelmente está relacionado com as diferentes funções exercidas pelos membros desta família. NEK1, o primeiro ortólogo da proteína NIMA descrito é uma serina/treonina e tirosina cinase, cuja função está relacionada principalmente com reparo de dano de DNA, regulação do cílio primário e controle do ciclo celular. A sinalização de reparo de dano de DNA é através da fosforilação por TLK1 (Tousled-Like Kinase), na Treonina 141, sinalizando para vias de reparo por homologia, estabilizando o complexo ATR-ATRIP (TLK1>NEK1>ATR). Além disso, foi visto que NEK1 interage e fosforila o canal iônico dependente de voltagem 1 (VDAC1), presente na mitocôndria. Esta interação demonstrou ser importante para a prevenção de apoptose, através do fechamento deste canal. Interessantemente, esta regulação pode ser importante para a regulação da atividade mitocondrial e, portanto, defeitos deletérios na atividade da NEK1 podem ter consequências para o metabolismo das células. De fato, estudos recentes mostraram que a perda de função da NEK1 tem consequências sobre a atividade mitocondrial das células, levando a um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio e morte celular. Levando isto em consideração, mutantes de NEK1 encontrados em pacientes com esclerose lateral amiotrófica familiar podem estar tendo defeitos na atividade mitocondrial, causando um aumento de espécies reativas de oxigênio, acúmulo de danos de DNA e susceptibilidade a morte celular, conhecidos hallmarks de doenças neurodegenerativas, como a ELA. Portanto, o trabalho buscou explorar os mecanismos moleculares afetados pela deleção de NEK1 e estudar o efeito de mutações pontuais de perda de função da NEK1 encontradas em pacientes de ELA, comparando com células com NEK1 silenciada. Para isso, foram selecionadas, através de bioinformática, duas mutações que demonstraram maiores efeitos deletérios para a atividade da cinase, sendo uma no domínio catalítico (Q132R) e outra próxima ao hipotético sítio de dimerização da NEK1, presente em um dos coiled-coils (R615G). Os resultados da deleção de NEK1 mostraram um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio nuclear e citoplasmático e sinalização de danos de dupla fita (?-H2AX), que foram reduzidos ao serem tratadas com n-acetil-cisteína, um conhecido sequestrador de espécies reativas de oxigênio. Ao serem transfectadas com NEK1 selvagem, a sinalização de DSB também reduziu, o que não ocorreu ao transfectar com os mutantes de ELA, revelando que ambos estão relacionados com este mecanismo. A principal particularidade destes mutantes está na formação do possível dímero de NEK1 para a sua autofosforilação, no qual o mutante R615G teve uma redução na interação com a NEK1 WT no ensaio de co-imunoprecipitação. Portanto, estudar variantes com mutação pontual são essenciais para compreensão dos mecanismos moleculares que estão envolvidos na progressão de doenças como a ELA, e NEK1 tem ganhado bastante destaque na busca de tratamentos mais eficazes (AU)

• Processo FAPESP: 18/13775-4 - A proteína quinase humana NEK1: a caracterização da sua ativação fisiológica por danos de DNA e a sua exploração como marcador biológico e alvo terapêutico em Câncer de Tireóide
• Beneficiário: Luidy Kazuo Issayama
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto