Aplicação da tecnologia portátil de sequenciamento MinION para análise do metagenoma viral

Autor(es)

Victória Simionatto Zucherato

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2023-06-06

Membros da banca

Svetoslav Nanev Slavov; Maurício Teixeira Lima; João Paulo Bianchi Ximenez

• Orientador: Svetoslav Nanev Slavov

Resumo

As tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração (SNG) mostraram um crescimento acelerado nos últimos anos. Uma das principais aplicações do SNG é a metagenômica, que identifica patógenos emergentes para os quais não há diagnóstico estabelecido. Uma técnica promissora e de custo relativamente baixo é a tecnologia portátil MinION. Um dos maiores problemas da plataforma MinION é a falta de protocolos otimizados (pré-preparo da amostra, concentração viral, extração e amplificação). Portanto, o objetivo desse trabalho é padronizar e otimizar os procedimentos de metagenômica viral aplicados ao sequenciamento de nanoporos. O controle do sequenciamento foi realizado utilizando vírus RNA (bolsa de sangue positiva para HIV, cycle threshold - Ct=25,8) e vírus DNA (citomegalovírus humano cultivado). Estes controles foram utilizados para padronizar os processos de concentração viral, extração e preparo de bibliotecas metagenômicas. Inicialmente, após a degradação enzimática do material do hospedeiro, foi realizada a concentração viral por ultracentrifugação, que foi consequentemente confirmada com microscopia eletrônica de transmissão. Além disso, foi realizada a concentração viral por método químico utilizando poliacrilamida linear. As amostras concentradas foram extraídas com dois kits diferentes a fim de comparação: QIAamp UltraSens Virus (QIAGEN) e High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume (Roche Life Science). Em seguida, comparamos diferentes métodos de fragmentação do DNA: fragmentação mecânica (Covaris), fragmentação química (endonucleases), amplificação pelo sistema de primer SMART-9N e amplificação isotérmica sem ligação dos fragmentos. Todas as amostras foram sequenciadas utilizando a flow cell 9.4.1 no dispositivo MinION. Na microscopia eletrônica de transmissão visualizamos várias partículas de HIV (tamanho esperado 80-100 nm) bem como uma abundância de fagos, que mostrou a importância da concentração viral. Em seguida, a análise bioinformática revelou que as amostras concentradas por LPA, extraídas pelo kit QIAamp UltraSens Virus e amplificadas pelo método SMART-9N apresentaram maior abundancia viral e número elevado de leituras dos vírus tidos como controles (HIV e CMV). Portanto, propusemos que a metagenômica por sequenciamento de nanoporos seja feita utilizando esses métodos e concluímos que a padronização de todos os procedimentos de pré-processamento de amostras é crucial para melhores resultados de sequenciamento utilizando a tecnologia MinION, que permitirá sua aplicação na área de metagenômica viral e na descoberta de patógenos virais desconhecidos ou reemergentes. (AU)

• Processo FAPESP: 21/09446-8 - Aplicação da tecnologia portátil de sequenciamento minion para a análise do metagenoma viral
• Beneficiário: Victória Simionatto Zucherato
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado