Investigação dos mecanismos intrínsecos à liberação de NETs por meio de proteômica

Autor(es)

Lorenna Rocha Reis

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Conjunto das Químicas (IQ e FCF) (CQ/DBDCQ)
• Data de defesa: 2023-06-01

Membros da banca

Graziella Eliza Ronsein; Flavia Carla Meotti; André Zelanis Palitot Pereira

• Orientador: Graziella Eliza Ronsein

Resumo

A fim de matar patógenos invasores, neutrófilos liberam redes extracelulares de DNA juntamente com proteínas citotóxicas, conhecidas como NETs (do inglês, neutrophil extracelular traps), em um processo chamado NETosis. Estudos mostram que os mecanismos de NETosis podem ser dependentes de cada estímulo. Assim, o estímulo forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) leva à liberação de NETs por meio da ativação da NADPH oxidase, enquanto a NETosis causada por ionóforos de cálcio, como a ionomicina, ocorre sem ativação da NADPH oxidase. Independentemente do estímulo, uma série de mudanças bioquímicas e estruturais precisam ocorrer nos neutrófilos antes do evento de liberação de NETs, incluindo a descondensação da cromatina e a degranulação de proteínas citotóxicas. Tais eventos não estão totalmente compreendidos, mas estudos recentes mostraram que proteínas citotóxicas associadas as NETs podem agravar patologias e causar danos vasculares. Neste trabalho, utilizamos estudos de proteômica, microscopia com células vivas (do inglês, live imaging) e com células fixadas para investigar os eventos iniciais da NETosis por dois ângulos diferentes. Primeiro, foi realizada uma investigação das alterações bioquímicas que ocorrem antes da liberação de NETs após o tratamento com ionomicina. Assim, a microscopia com células vivas mostrou que os neutrófilos tratados com ionomicina perdem rapidamente seu núcleo polimórfico. Além disso, o fracionamento celular juntamente com os estudos proteômicos apontaram para profundas mudanças bioquímicas observadas dentro e ao redor do núcleo dos neutrófilos após 2 minutos de tratamento com ionomicina, tais como a reorganização do citoesqueleto, a redistribuição nuclear de proteínas relacionadas à remodelação da actina e a citrulinação de proteínas ligantes de actina e de proteínas estruturais nucleares. Na sequência, foi realizada uma comparação da resposta dos neutrófilos a três estímulos diferentes, a saber, PMA, ionomicina e o peptídeo N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP). Curiosamente, a liberação de NETs ocorreu após 30 minutos de tratamento com ionomicina e apenas após 90 minutos de estimulação com PMA. Monitoramos as células por até 120 minutos e o peptídeo quimiotático fMLP não induziu a liberação de NETs. Além disso, apenas os neutrófilos tratados com fMLP e PMA ativaram a NADPH oxidase. A análise das proteínas secretadas pelos neutrófilos após cada tratamento mostrou que os neutrófilos tratados com PMA e fMLP liberaram mais proteínas relacionadas à adesão e migração de neutrófilos e regulação positiva da atividade do superóxido. Em contraste, os neutrófilos tratados com ionomicina apresentaram um secretoma mais citotóxico, devido ao enriquecimento de proteínas dos grânulos azurófilicos. Em conclusão, ao explorar os eventos que ocorrem antes da liberação de NETs, nossos estudos revelaram mediadores bioquímicos envolvidos no processo e mostraram que, apesar de levarem ao mesmo resultado final, PMA e ionomicina desencadeiam respostas diferentes em neutrófilos estimulados. (AU)

• Processo FAPESP: 17/17270-1 - Estudo do efeito da HDL em neutrófilos ativados
• Beneficiário: Lorenna Rocha Reis
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto