Análise do papel funcional de LOXL3 em glioblastoma

Autor(es)

Talita de Sousa Laurentino

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina (FM/SBD)
• Data de defesa: 2024-01-30

Membros da banca

Sueli Mieko Oba Shinjo; Erico Tosoni Costa; Wellingson Silva Paiva; Roseli da Silva

• Orientador: Sueli Mieko Oba Shinjo

Resumo

Os astrocitomas, são tumores que se originam das células astrocíticas do sistema nervoso central. Os astrocitomas foram classificados pela Organização Mundial da Saúde com base na malignidade, considerando características histológicas. Recentemente, essa classificação foi incluiu características moleculares, como mutações e outras alterações cromossômicas. O glioblastoma (GBM), categorizado como grau 4 entre os astrocitomas difusos e caracterizado por IDH selvagem, é o glioma mais prevalente e apresenta o prognóstico mais desfavorável. Com o intuito compreender os processos de gliomagênese, nosso laboratório realizou uma comparação dos genes mais expressos no GBM em relação ao astrocitoma grau 1, visando potenciais alvos terapêuticos. O gene responsável pela codificação da enzima lisil oxidase (LOX) foi identificado com uma expressão elevada no GBM. Esta enzima faz parte de uma família composta por cinco membros - LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3 e LOXL4 - desempenhando um papel crucial na catalisação das ligações cruzadas do colágeno e da elastina. Sua atuação é essencial para conferir rigidez à matriz extracelular (MEC). Neste presente estudo, foram realizadas análises para compreender melhor o papel de LOXL3 em astrocitomas. Análises in silico mostraram que LOXL3 é altamente expresso em GBM, com maior expressão no subtipo molecular de pior prognóstico, o mesenquimal. Além disso, a expressão de LOXL3 influenciou no prognóstico dos pacientes com GBM. Pacientes com maior expressão de LOXL3 apresentaram menor sobrevida do que àqueles com menor expressão do gene. O silenciamento transitório de LOXL3 na linhagem celular de GBM humano U87MG levou a uma diminuição da proliferação, adesão e invasão celular, e um aumento de apoptose e da superfície celular. Análises de transcriptoma mostraram um aumento da expressão de genes que codificam proteínas relacionadas a MEC, adesão celular, e componentes do citoesqueleto. Análises in sílico no banco de dados do TCGA mostraram correlação dos níveis de expressão de LOXL3 e de genes que codificam tubulinas no subtipo mesenquimal. A expressão dos genes da família LOX aumenta de acordo com malignidade dos astrocitomas. Com base na influência de LOXL3 na estabilidade da MEC, foram realizadas análises in silico em banco de dados públicos para avaliar a correlação dos genes da família LOX e os que codificam componentes da MEC nos astrocitomas diferentes graus de malignidade e com e sem mutação de IDH. Foi observado um aumento progressivo na expressão dos cinco membros da família LOX conforme o aumenta o grau de malignidade. Os níveis de expressão de LOX, LOXL1 e LOXL3 correlacionaram-se positivamente com os de genes do matrissoma. Foram observadas correlações específicas, como LOXL1 em gliomas de baixo grau (LGG) com mutação no IDH (IDHmut), LOXL3 em LGG com tipo selvagem de IDH (IDHwt) e forte correlação de LOX em GBM. Essas associações podem explicar o aumento na rigidez da MEC e na agressividade tumoral de LGG-IDHmut para LGG-IDHwt até GBM. Além disso, a expressão do fator de transcrição sensível à mecanotransdução, -catenina, aumentou com o grau de malignidade e correlacionou-se com LOXL1 e LOXL3, sugerindo seu envolvimento na via de sinalização. Para dar continuidade a análises do papel funcional de LOXL3 em GBMs, foi realizado um nocaute gênico através do sistema de CRISPR-Cas9 nas linhagens celulares de GBM humano, U87MG e U251. A análise do transcriptoma mostrou uma diminuição de expressão de genes relacionados à acetilação da tubulina nas células U87MG, confirmada por Western blot, corroborando com as correlações observadas anteriormente em análises in silico. Além disso, observou-se uma redução de expressão de genes ligados ao ciclo celular em ambas as linhagens celulares. Também foram observados através de ensaios funcionais atraso na progressão do ciclo celular e alterações marcantes no fuso mitótico durante as fases de metáfase-anáfase. A análise da morfologia nuclear indicou alterações associadas à catástrofe mitótica em células U87MG e à senescência em células U251. Corroborando com dados obtidos anteriormente, observou-se uma diminuição nos processos de adesão e migração celular nas células nocauteados para LOXL3. A análise do banco de dados do TCGA revelou uma correlação entre a expressão do LOXL3 e genes relacionados ao ciclo celular, morte celular e senescência em casos GBM com TP53 mutado. Além disto, observou-se que a coexpressão de LOXL3 e CCNE1 impactou a sobrevivência de pacientes com GBM com mutação no TP53, sugerindo um potencial alvo terapêutico combinado para casos de GBM com essa mutação. Esses dados corroboram para descrever o papel funcional de LOXL3 em GBM envolvendo a organização do citoesqueleto, principalmente relacionado a tubulina e microtúbulos. Ainda, LOXL3 está relacionado a processos como invasão tumoral e rigidez da MEC. Esses resultados sugerem a relevância de LOXL3 nos astrocitomas, reforçando que pode ser um potencial alvo terapêutico (AU)

• Processo FAPESP: 21/01207-4 - Análise do papel funcional de LOXL3 em glioblastoma
• Beneficiário: Talita de Sousa Laurentino
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado