Deciphering the effect of N-glycoslation pathway gene deletion in Aspergillus nidulans enzyme secretion

Autor(es)

Jaqueline Aline Gerhardt

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2023-10-27

Membros da banca

André Ricardo de Lima Damásio; Fernando Segato; Leonardo Talachia Rosa; Maria Celia Bertolini; Evandro Araújo de Souza

• Orientador: André Ricardo de Lima Damásio

Resumo

Os fungos filamentosos do gênero Aspergillus têm uma capacidade natural de degradar a biomassa lignocelulósica. Esses microrganismos são capazes de secretar grandes quantidades de enzimas ativas em carboidratos (CAZymes) que sustentam seu estilo de vida saprofítico. Dentre essas CAZymes, podemos citar as beta-xilosidases, que são classificadas como glicosídeo hidrolases (GHs). Eles desempenham um papel crucial na quebra da biomassa vegetal, liberando xilose dos xilooligossacarídeos durante a degradação da porção de hemicelulose. Além disso, Aspergillus spp. possuem todo o maquinário para modificações pós-traducionais (PTMs), como clivagem proteolítica, formação de ligações dissulfeto e glicosilação de proteínas. Esta capacidade proporciona vantagens na utilização destes organismos como hospedeiros para produção de proteínas em larga escala. Um PTM prevalente em sistemas eucarióticos é a glicosilação ligada à asparagina ou N-glicosilação. A N-glicosilação de proteínas é indispensável para uma ampla gama de processos celulares, incluindo respostas imunes, comunicação celular, tráfego intracelular, estabilidade, secreção, dobramento e atividade proteica. Neste estudo, exploramos como os genes associados à síntese de N-glicanos impactam a produção de proteínas em Aspergillus nidulans, com o objetivo de abordar as dificuldades na produção de quantidades significativas de proteínas recombinantes a partir de fungos filamentosos. Nossas observações anteriores revelaram que mutações nos sitios de N-glicosilação têm efeitos notáveis na estabilidade térmica, secreção, enovelamento e eficiência catalítica de uma beta-xilosidase GH3 recombinante (BxlB) produzida em A. nidulans. Com base nisso, formulamos a hipótese de que a deleção de genes envolvidos na via de montagem de N-glicanos poderia influenciar na secreção de proteínas recombinantes. Para testar nossa hipótese, projetamos a tecnologia multiplex CRISPR/Cas9 para deletar sistematicamente 14 genes associados à montagem de N-glicano (alg7, alg13, alg1, alg2, alg11, rft1, alg3, alg9, alg12, alg6 e AN5748) e controle de qualidade proteica (clxA, gtbA e uggt) em A. nidulans, resultando em nove mutantes individuais viáveis. Posteriormente, o gene bxlb (AN8401) foi transformado em cada mutante individual, bem como na cepa de referência para expressão constitutiva, avaliando cuidadosamente a secreção de BxlB e a atividade enzimática. A deleção da maioria dos genes alvo não teve impacto na secreção de proteínas ou no crescimento de fungos. Curiosamente, a atividade enzimática de BxlB produzida por cepas mutantes foi reduzida significativamente, enquanto a secreção de BxlB permaneceu inalterada na maioria dos mutantes. Uma exploração mais aprofundada revelou que a deleção combinada de alg3 e alg9 aumentou a secreção de BxlB, mantendo os mesmos parâmetros cinéticos em relação à cepa referência. Em contraste, a deleção combinada de alg3, alg6 e alg9 não afetou a secreção de BxlB, mas reduziu a eficiência catalítica em 20%, sugerindo que a glicose interna do N-glicano é importante ao longo do controle de qualidade do retículo endoplasmático, pelo menos parcialmente. Além disso, os secretomas de cepas glicomutantes foram analisados por proteômica, mostrando que a deleção de genes envolvidos na síntese de N-glicanos diminuiu a secreção geral de algumas CAZymes, enquanto um agrupamento específico de mutantes de CAZymes regulados positivamente também foi observado, sugerindo N-glicanos truncados favorecem o enovelamento e a secreção de um grupo de proteínas, ao mesmo tempo que interferem negativamente na produção de outro grupo. Esses dados contribuem para a compreensão da importância dos N-glicanos para o enovelamento, secreção e função de proteínas em fungos filamentosos, que são fábricas de células microbianas amplamente utilizadas para produção de enzimas e outras proteínas recombinantes. Estudar o impacto das deleções genéticas nas estruturas de N-glicanos pode fornecer informações valiosas sobre o significado das modificações pós-traducionais tanto no processo geral de secreção de proteínas quanto na síntese de proteínas recombinantes em fábricas de células fúngicas (AU)

• Processo FAPESP: 18/16437-2 - Decifrando o efeito da deleção da via N-glicosilação na secreção de enzimas de Aspergillus nidulans
• Beneficiário: Jaqueline Aline Gerhardt
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado