Padronização da técnica SHERLOCK (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking) utilizando a proteína Cas13a para diagnóstico do Vírus Respiratório Sincicial em pacientes pediátricos

Autor(es)

Camila Pereira Soares

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Ciências Biomédicas (ICB/SDI)
• Data de defesa: 2023-06-06

Membros da banca

Edison Luiz Durigon; Flavia Jacqueline Almeida; Jansen de Araujo; João Renato Rebello Pinho

• Orientador: Edison Luiz Durigon

Resumo

O RSV é um vírus amplamente distribuído no mundo e é o principal vírus envolvido em infecções respiratórias do trato inferior. A principal população de risco dessas infecções são crianças menores de 5 anos. Nesse contexto, os métodos de diagnósticos laboratoriais se apresentam extremamente importantes devido a similaridade entre os sintomas causados pela infecção do RSV com outros vírus respiratórios. Esse trabalho propôs utilizar a enzima LwCas13a como detectora do RSV em amostras de pacientes pediátricos tendo como base a técnica SHERLOCK. A proteína recombinante foi obtida utilizando cromatografia de afinidade e gel filtração para purificação. O RNA alvo foi desenhado com base em uma região conservada no gene M do RSV. Em amostras clínicas previamente amplificadas por PCR convencional, 100% foram detectadas pela enzima e em amostras sem amplificação prévia 45,3% foram detectadas. Não houve reação cruzada em nenhum dos testes com outros vírus de importância respiratória. Durante o enfrentamento à Covid-19 em 2020 e 2021, produzimos um teste de ELISA para detectar anticorpos IgG/IgA/IgM contra duas nucleoproteínas recombinantes, uma comercial e uma produzida in house. Os teste foi padronizado em comparação ao ensaio padrão ouro de neutralização viral (VNT100 ). Para todas as três imunoglobulinas obtivemos valores acima de 88% de sensibilidade e 94% de especificidade. O ensaio foi empregado na triagem de doadores e receptores de plasma convalescente, no diagnóstico fornecido para 7 hospitais público da cidade de São Paulo. Além disso, padronizamos um ensaio ELISA para IgG utilizando sangue capilar seco coletado em papel de filtro. Na tentativa de facilitar a coleta de amostras em um cenário de pandemia. (AU)

• Processo FAPESP: 18/23680-0 - Padronização da técnica Sherlock (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking) utilizando a proteína Cas13a para diagnóstico do vírus respiratório sincicial em pacientes pediátricos
• Beneficiário: Camila Pereira Soares
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado