Microfluidic systems for incorporation of small interfering RNA (siRNA) in cationic liposomes and on-chip transfection of multicellular tumor spheroids

Autor(es)

Ismail Es

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia Química
• Data de defesa: 2020-08-12

Membros da banca

Lucimara Gaziola de la Torre; CamilIa Foged; Tiago Albertini Balbino; Marco Cardoso Marques; Rosiane Lopes da Cunha

• Orientador: Lucimara Gaziola de la Torre

Resumo

Veículos nanoterapêuticos baseados em lipídios são uma solução promissora para superar as limitações atuais dos sistemas convencionais de administração de medicamentos ou genes. Apesar de seu vasto potencial, suas aplicações clínicas ainda são limitadas devido a impedimentos técnicos em síntese eficiente. A demanda pelo desenvolvimento de plataformas tecnológicas eficazes para a produção com alta produtividade desses compostos está aumentando rapidamente. Nesse contexto, a microfluídica emerge como uma ferramenta tecnológica robusta na síntese contínua de sistemas vetoriais baseados em lipídios para entrega de medicamentos ou genes. Esta tese de doutorado visa o desenvolvimento tecnológico de sistemas microfluídicos para incorporar pequenos RNA interferentes (siRNA) em lipossomas catiônicos (CLs) com propriedades furtivas (Stealth) e avaliar a transfecção de agentes nanoterapêuticos de siRNA em esferóides multicelulares, utilizando microchip. Na primeira parte, os CLs foram eletrostaticamente complexados com siRNA explorando o efeito da razão molar de cargas para entender como o siRNA interage com os lipossomas. Após análise através de espalhamento de luz dinâmica (DLS), a razão molar de cargas (R ±) ideal foi de 3,27. Nesta condição foram realizados ensaios de acessibilidade ao siRNA e eletroforese em gel de agarose. A multilamelaridade dos lipossomas foi confirmada por microscopia Crioeletrônica. Um efeito "knockdown" significativo da atividade da luciferase nas células HeLa foi obtido sem observar efeito citotóxico nas célula. Na segunda parte, CLs convencionais e furtivos foram produzidos em uma plataforma microfluídica de alto rendimento (baseada em advecção caótica) e avaliados aspectos físico-químicos, estruturais, morfológicos e biológicos desses sistemas lipídicos. As análises raio X a baixo ângulo (SAXS) e Cryo-TEM confirmaram a unilamelaridade dos CLs e os estudos de transfecção in vitro mostraram que eles poderiam fornecer pDNA às células cancerígenas. O processo desenvolvido alcançou uma produtividade 70 vezes maior na produção de CL em comparação com o processo de focalização hidrodinâmica em microfluídica. Além disso, este processo evitou com sucesso a formação de micelas nos microcanais, o que era inevitável em dispositivos de foco de fluxo hidrodinâmico. Também foi empregada a técnica de concentração à vácuo centrífugo como processo alternativo de destilação para remover o excesso de etanol na formulação lipossômica final, mantendo a estrutura unilamelar dos CLs. Na terceira parte, uma plataforma microfluídica baseada em difusão foi usada para sintetizar sistemas lipídicos contendo siRNA com propriedades furtivas, avaliando duas estratégias de processo: uma etapa (fosfolipídios e polímero PEG com siRNA para autoagregação lipídica e complexação com material genético simultaneamente) e duas etapas (CLs furtivos pré-formadas para associação com siRNA). Abordagens de uma e duas etapas levaram à síntese de nanocarreadores lipídicos com diferentes propriedades físico-químicas, estruturais e morfológicas. A análise SAXS confirmou que a inserção do PEG na formulação teve um impacto diferente nas propriedades estruturais. Na última parte, foram desenvolvidos microchips para a formação e transfeção de esferoides de células HEK-293 que expressam GPF em condição estática e dinâmica . Os esferóides foram transfectados usando siRNA no microdispositivo de cultivo em sistema estático. Os esferóides produzidos foram caracterizados morfologicamente utilizando técnicas avançadas de microscopia e os níveis de transfecção foram determinados pela avaliação da intensidade da GFP. Os estudos de transfecção mostraram que plataformas microfluídicas estáticas não eram eficazes para testar formulações de fámacos ou genes. Portanto, novas estratégias são propostas para superar a limitação dos microdispositivos estáticos. Esta dissertação fornece contribuições originais de grande importância no campo da microfluídica e sua aplicação na nanomedicina (AU)

• Processo FAPESP: 15/14468-0 - SISTEMAS MICROFLUÍDICOS PARA A INCORPORAÇÃO DE SMALL INTERFERING RNA (siRNA) EM LIPOSSOMAS CATIÔNICOS E PARA TRANSFECÇÃO IN VITRO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS DESTINADOS À TERAPIA GÊNICA
• Beneficiário: Ismail Es
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado