Explorando o metabolismo oxidativo do ácido úrico e suas implicações na disfunção endotelial

Autor(es)

Bianca Dempsey Pinto

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Conjunto das Químicas (IQ e FCF) (CQ/DBDCQ)
• Data de defesa: 2024-03-18

Membros da banca

Flávia Carla Meotti; Luis Eduardo Soares Netto

• Orientador: Flávia Carla Meotti

Resumo

O ácido úrico é o produto final do metabolismo de purinas em humanos e está presente no plasma como urato em concentrações de 50 a 420 µM, sendo que níveis elevados caracterizam hiperuricemia. Inicialmente considerado um antioxidante plasmático, estudos indicam que o ácido úrico pode causar danos oxidativos, inflamação e disfunção endotelial,. Nosso grupo mostrou que durante a inflamação, a peroxidase MPO presente nos neutrófilos oxida o ácido úrico gerando espécies reativas. Neste trabalho, em células HUVEC, identificamos outra peroxidase capaz de reagir com o ácido úrico, a peroxidasina (PXDN). Utilizando espectrometria de massas, identificamos um dos produtos de reação da PXDN com o ácido úrico, o 5-hidroxiisourato, cuja quantidade diminuiu quando a PXDN foi inibida. Também observamos que o ácido úrico parece desviar a enzima de sua função principal, o crosslinking do colágeno IV. Ensaios funcionais mostraram que a adesão e a migração celular foram reduzidas na presença de urato, ou quando a PXDN foi inibida ou silenciada. Considerando esses achados, utilizamos ferramentas proteômicas para aprofundar o estudo dos efeitos do ácido úrico nas células HUVEC. Os resultados mostraram que o ácido úrico causou alterações na expressão de diversas proteínas, como chaperonas, proteínas de sinalização redox e proteínas envolvidas no processo inflamatório. Como validação dos dados obtidos, monitoramos alterações nos níveis de oxidação nas células HUVEC na presença de ácido úrico utilizando a sonda roGFP2-Grx1. O ácido úrico aumentou a oxidação da sonda de maneira dependente da concentração. Quando a PXDN foi inibida, a oxidação celular na presença de ácido úrico diminuiu. Além disso, também observamos um aumento de proteínas uratiladas na presença de ácido úrico. Por fim, utilizando a sonda fluorescente Proteostat, observamos um aumento nos níveis de proteínas mal-enoveladas e agregados protéicos em células tratadas com ácido úrico. Por último, constatamos que o ácido úrico induz um aumento na adesão de monócitos às células HUVEC, bem como um aumento na expressão das proteínas de adesão relacionadas ao processo inflamatório, ICAM e VCAM. Em seguida, expandimos os estudos para uma proteína identificada exclusivamente em tratamentos com ácido úrico, a TRC40. Até então, a única função conhecida da TRC40 era direcionar proteínas para o retículo endoplasmático. Nossos estudos demonstram uma segunda função para a TRC40, que, quando oxidada, assume outra conformação e possui atividade de chaperona, prevenindo a agregação proteica. Usando células HeLa, demonstramos que a TRC40 se acumula em regiões específicas da célula e parece interagir com as chaperonas Hsp70 e Hsp110. O silenciamento da TRC40 causou uma diminuição na proliferação celular e na viabilidade. Utilizando novamente a sonda roGFP2-Grx1, monitoramos a oxidação celular após adição de H2O2, e com o uso da sonda Proteostat, também monitoramos os níveis de agregados proteicos após a adição de H2O2. Em ambos os casos, as células controle se recuperaram muito mais rapidamente do estresse, enquanto as células knockout permaneceram com níveis elevados de oxidação e agregados por períodos mais longos, sugerindo um papel crucial da TRC40 para que as células lidem com o estresse causado pela presença de oxidantes. (AU)

• Processo FAPESP: 19/16224-1 - Análise proteômica do secretoma de células endoteliais: estudo sobre a correlação do ácido úrico e o desenvolvimento da Aterosclerose
• Beneficiário: Bianca Dempsey Pinto
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto