Caracterização do papel de EXOSC8 na diferenciação de células tronco embrionárias em células precursoras neuronais de murinos

Autor(es)

Luiz Henrique de Santana Maniero

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Conjunto das Químicas (IQ e FCF) (CQ/DBDCQ)
• Data de defesa: 2025-06-24

Membros da banca

Carla Columbano de Oliveira; Danilo Bilches Medinas

• Orientador: Carla Columbano de Oliveira

Resumo

Compreender a interação entre a regulação transcricional e translacional é essencial para decifrar os mecanismos de diferenciação de células-tronco. Neste estudo, utilizamos uma abordagem abrangente para investigar o papel de EXOSC8, uma proteína do complexo RNA Exossomo (EC), na diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongo (mESCs) em células precursoras neurais (NPC). Padronizamos um protocolo para formação de corpos embrioides (EBs) em que utilizando placas com o fundo em forma de diamante e controlando o número de células semeadas, obtivemos uma indução neural sincronizada. A análise transcricional confirmou a diminuição progressiva na expressão de genes de pluripotência e o aumento na expressão de marcadores neuro-ectodérmicos ao longo das fases da diferenciação. Estabelecemos e validamos linhagens mESC estáveis expressando Ribo-STAMP e construímos RNAs de interferência para EXOSC8, induzíveis por doxiciclina, alcançando uma depleção proteica de 88%. A integração do Ribo-STAMP em bulk RNA-seq e single cell RNA-seq revelou mudanças dinâmicas tanto no transcriptoma quanto no translatoma, incluindo genes regulados exclusivamente em nível translacional. A depleção de EXOSC8 resultou em alterações na expressão de genes envolvidos na ubiquitinação de proteínas e na vigilância de mRNA, confirmando o papel do exossomo de RNA no controle pós- transcricional. Por meio de imunofluorescência e fracionamento subcelular, observamos uma relocalização específica de EXOSC8 em cada estágio da diferenciação, com a transição de uma distribuição equilibrada entre núcleo e citoplasma em mESCs para um enriquecimento citoplasmático predominante nos estágios intermediários e retorno parcial ao núcleo em precursores neurais. Ensaios de co-imunoprecipitação, seguidos de espectrometria de massas, revelaram um interactoma de EXOSC8 específico para cada estágio da diferenciação, passando de fatores nucleolares e da biogênese ribossomal para reguladores de cromatina, transportadores de mRNA e, por fim, proteínas do citoesqueleto envolvidas no desenvolvimento axonal. Os achados sugerem que a localização subcelular de EXOSC8 é funcionalmente programada, permitindo interações específicas no contexto que sustentam a progressão da linhagem e a diferenciação neuronal. Por fim, a análise do transcriptoma e translatoma em nível de célula única revelou heterogeneidade celular e mudanças regulatórias dinâmicas durante a diferenciação sob a depleção de EXOSC8. Coletivamente, este estudo estabelece um modelo experimental robusto para elucidar a regulação transcricional, translacional e espacial durante a diferenciação celular e destaca o complexo do exossomo como um regulador modular de RNA durante o desenvolvimento. (AU)

• Processo FAPESP: 18/17562-5 - Caracterização das proteínas neuronais que interagem com a subunidade EXOSC8 (Rrp43) do exossomo e regulam sua atividade
• Beneficiário: Luiz Henrique de Santana Maniero
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto