Tropomiosinas contendo 5-hidroxitriptofano: sondas especificas para interações no filamento fino

Autor(es)

Aurea Denise de Sousa Soller Ferreira

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo. , gráficos, ilustrações, tabelas.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Conjunto das Químicas (IQ e FCF) (CQ/DBDCQ)
• Data de defesa: 2002-03-08

Membros da banca

Chuck Shaker Farah; Sergio Teixeira Ferreira; Shirley Schreier; Martha Meriwether Sorenson; Sérgio Verjovski Almeida

• Orientador: Shaker Chuck Farah
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica
• Indexada em: Banco de Dados Bibliográficos da USP-DEDALUS
• Localização: Universidade de São Paulo. Biblioteca do Conjunto das Químicas; T/574.19245; S725t

Resumo

Tropomiosina (Tm) é uma proteína coiled-coil de 284 aminoácidos que interage de uma maneira cabeça-cauda para formar filamentos e liga-se a filamentos de actina. Em músculos esqueléticos Tm interage com Troponina (Tn) e participa na regulação da contração muscular de forma dependente de cálcio. Após a análise da seqüência de isoformas de Tm observamos que os resíduos 258-275 apresentam um padrão de polaridade específico para isoformas de músculos estriados, porém atípico para estruturas coiled-coil. Baseados nessas observações, produzimos versões recombinantes da tropomiosina polimerizável (ASTm) e não polimerizável (nfTm) com 5-hidroxitriptofano (50HW) incorporado em posições específicas na região C-terminal. A caracterização desses mutantes permitiu a identificação de posições em regiões da molécula onde Tm interage com várias proteínas (actina, troponina e outras moléculas de tropomiosina) porém cada sonda apresenta fluorescência especificamente sensível a apenas uma dessas interações. A tropomiosina com 50HW na posição 269 tem sua fluorescência sensível à polimerização. Utilizando esse mutante, obtivemos valores para a constante de afinidade para a polimerização de Tm em várias concentrações de sal, que descrevem a alta dependência entre interação cabeça-cauda e força iônica (Sousa & Farah, J. Biol. Chem., 2002, J. Biol. Chem., 277 (3), 2081-8). Tropomiosinas contendo 50HW nas posições 261 e 263 possuem fluorescência seletivamente sensível à ligação de actina e troponina, respectivamente (Sousa & Farah, 2001, Biophysical J., 80 (1), Part 2, 91ª, abstract). Utilizando fragmentos de TnT, mapeamos a sensibilidade de AS263(50HW) à região T1 da TnT (Oliveira et al., 2000, J. Biol. Chem., 275 (36), 27513-9). Obtivemos valores de afinidade para ligação da troponina à tropomiosina: em ausência de actina -Ca2+ (2, 5 x 106M-1) e em presença de actina +Ca2+ (4, 3 x 107 M-1) e de actina -Ca2+ (5, 3 x 107 M-1). Utilizando os mutantes não polimerizáveis (nfTm) investigamos a influência da interação cabeça-cauda nas interações para as quais cada sonda é sensível (Sousa et al., Biophys. J., 2002, abstract in press). (AU)

• Processo FAPESP: 00/00686-0 - Investigação das interações envolvidas na montagem do filamento fino de músculos esqueléticos: utilizando mutantes de tropomiosina marcados fluorescentemente na região COOH-terminal
• Beneficiário: Aurea Denise de Sousa Soller Ferreira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado