Caracterização fisico-quimica e biologica de uma fosfolipase A2 isolada do veneno de Bothrops moojeni

Autor(es)

Andrana Karla Calgarotto

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2008-03-14

Membros da banca

Caroline Ribeiro de Borja Oliveira; Hiroshi Aoyama

• Orientador: Sergio Marangoni

Resumo

Bothrops moojeni é uma espécie de serpente de grande importância devido a sua ampla distribuição na América do Sul e Central além dos quadros clínicos que o veneno causa. Dentre as espécies peçonhentas brasileiras o gênero Bothrops é o mais numeroso e é o que apresenta os maiores índices de notificações relacionados a acidentes ofídicos. Os venenos de serpentes possuem uma mistura de substâncias biologicamente ativas sendo a maior parte composta por proteínas. Fosfolipases A2 (PLA2), proteínas presentes no veneno de serpentes, agem hidrolisando fosfolipídios de membrana na posição sn2 liberando lisofosfolipídios e ácidos graxos, além de exibir uma ampla variedade de efeitos farmacológicos. A isoforma de fosfolipase A2 (PLA2), denominada BmTX-I foi isolada através de um sistema de cromatografia em HPLC utilizando uma coluna de fase reversa µ-Bondapak C18. O alto grau de pureza foi confirmado através de eletroforese em SDS-PAGE Tricina (16,5%) e também através da determinação da massa molecular (14,238.71 Da) por espectrometria de massas (MALDI Tof). A caracterização cinética da BmTX-I PLA2 (Asp49) mostrou que tal isoforma é altamente estável e apresenta um pH ótimo de 8,0 e temperatura de 37º C. Frente a diferentes concentrações do substrato ácido 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzóico a BmTX-I mostrou um comportamento com tendência alostérica. Na ausência de Ca2+ e na presença de alguns íons divalentes tais como Mg2+, Mn2+ e Cd2+ (na concentração de 10mM) a atividade BmTX-I foi significativamente diminuída, já na presença de Ca2+ (1mM) e com os mesmos íons divalentes citados apresentou uma discreta atividade. Também foi demonstrado o efeito inibitório de crotapotinas crotálicas sobre a atividade PLA2 da BmTX-I. A análise de composição de aminoácidos mostra que se trata de uma proteína de caráter básico pela alta presença de Lys, His e Arg. A presença de 14 resíduos de cisteína sugere a formação de 7 pontes dissulfeto. O estudo de homologia seqüencial da região N-terminal entre BmTX-I com outras PLA2 (Asp49) revelou um alto grau de homologia. O efeito neurotóxico in vitro do veneno total e da BmTX-I foi analisado na preparação biventer cervicis de pintainho. Nossos resultados mostraram que a ação do veneno de Bothrops moojeni na junção neuromuscular é menos potente quando comparado com venenos crotálicos, já que estes últimos levam a um bloqueio muito mais rápido e usando-se baixas concentrações. No entanto, não se pode negar que houve uma ação neurotóxica in vitro. O completo bloqueio tanto do veneno total quanto da BmTX-I não foi acompanhado pela inibição das respostas ao potássio (KCl) e a acetilcolina (ACh), exceto em altas concentrações de veneno (50 e 100 µg/ml) o que demonstra uma ação pré-sináptica primordial. Os testes in vivo do veneno total e da fração BmTX-I demonstraram o efeito miotóxico através da liberação de creatina quinase (CK) e o efeito inflamatório através de edema de pata e liberação de interleucina-6 (IL-6). O comportamento de liberação de CK foi semelhante tanto para o veneno total como para a PLA2 BmTX-I, os quais tiveram o maior liberação de CK uma hora após a injeção i.m. Oito horas após a injeção os níveis de CK estavam similares aos do controle. Ocorreu liberação de IL-6 bem como ação edematizante tanto do veneno total como da BmTX-I. A reprodutibilidade dos efeitos farmacológicos, só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas que mantenham a integridade da função biológica. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência como HPLC, através do qual podemos isolar a BmTX-I em um único passo cromatográfico e o grau de pureza confirmado por espectrometria de massa. Estes resultados podem ser associados com a sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada por veneno total ou frações impuras. Essa abordagem pode ser aplicada nos estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológicos e farmacológicos, podendo revelar mecanismos ainda desconhecidos na relação estrutura-função das PLA2 procedentes de veneno de serpentes (AU)

• Processo FAPESP: 06/52309-1 - Propriedades estruturais, enzimaticas e farmacologicas de novas isoformas isoladas do veneno de bothrops moojeni.
• Beneficiário: Andrana Karla Calgarotto
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado