Identificação e caracterização de chaperones de secreção no genoma do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis patovar citri

Autor(es)

Letícia Khater

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2006-10-02

Membros da banca

Carlos Henrique Inacio Ramos; Jose Camillo Novello; Gonçalo Amarante Guimarães Pereira; Michel Georges Albert Vincentz; Ana Paula Ulian de Araujo

• Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos

Resumo

A anotação automática de genes através do sequenciamento completo do genoma de um patógeno possibilita estudar e compreender a biologia e os mecanismos de infecção, proporcionando sistemas de controle e tratamento de pragas e doenças. Genes são anotados por homologia e as informações gerais obtidas fornece indicações sobre a filognia do organismo, organização dos genes, vias metabólicas, etc. A análise cuidadosa desta anotação é necessária para identificar e caracterizar proteínas que não possuem homologia com organismos já seqüenciados e ficam anotadas como proteínas hipotéticas. Dentre estas, encontram-se as proteínas responsáveis pelo auxílio da translocação de outras proteínas, designadas chaperones de secreção, as quais não possuem homologia com bactérias e, portanto, não foram identificadas no fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Os genes, que possivelmente codificam estas chaperones, foram selecionados do genoma do patógeno com base nas características comuns às chaperones desta família. Este trabalho objetivou identificar, dentre as proteínas denominadas hipotéticas, quais poderiam ser chaperones de secreção através da interação protéica observada com a metodologia de duplo-híbrido. A biblioteca de duplo-híbrido foi gerada a partir de 40 possíveis genes de chaperones de secreção selecionados. Esta biblioteca foi co-transformada com a biblioteca de fragmentos de todos os genes de Xac, possibilitando a identificação de interações entre possíveis chaperones de secreção e outras proteínas desta bactéria. Dentre estas foram selecionadas 6 proteínas para clonagem dos respectivos cDNAs em vetor de expressão da família pET: A hipotética chaperone flagelar XAC1990 (15046.1) e a proteína exportada FlgK; XAC1977 (6776.1), as hipotéticas XACb0033 (10073.2) e XACb0032 (11005.1) pertencentes ao sistema secretório tipo IV, a hipotética chaperone XACa0025 (10039.1) e a transposase XAC3248 (40041.17). As proteínas XACb0032 (11005.1), XACa0025 (10039.1) e a transposase XAC3248 (40041.17) permaneceram insolúveis após expressão e tentativas de ressolubilização. Já a proteína XACb0033 (10073.2), foi purificada e caracterizada sendo realizado ensaios de cristalização com a mesma. A possível chaperone flagelar XAC1990 (15046.1), FlgN e a proteína exportada FlgK também foram purificadas e caracterizadas além de ser confirmada in vitro a interação obtida por duplo-híbrido em levedura (in vivo). Apenas FlgK foi submetida a ensaios de cristalização, uma vez que XAC1990 degrada-se em poucos dias após purificação. Para a caracterização destas duas proteínas, foram utilizadas técnicas biofísicas como o dicroísmo circular e fluorescência do triptofano. Estas técnicas possibilitaram a caracterização da estrutura secundária das proteínas e sua estabilidade térmica. Através dos experimentos de desenovelamento térmico foi constatado que a desnaturação térmica é parcialmente irreversível para as duas proteínas. Estes experimentos caracterizaram a estabilidade das proteínas, mas não foram adequados para confirmar a interação observada pelo duplo-híbrido. Todavia, a confirmação in vitro do resultado obtido in vivo foi possível através do resultado de gel filtração analítica e do ensaio de co-preciptação (¿pull down¿). A conclusão final é a identificação de uma proteína hipotética em Xanthomonas axonopodis pv. citri sendo que, por homologia, também poderão ser identificadas as proteínas de Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xanthomonas campestris pv. campestris e Xanthomonas campestris pv. vesicatoria como FlgN (AU)

• Processo FAPESP: 01/13898-8 - Interações proteína-proteína em Xanthomonas: Chaperones de secreção tipo III
• Beneficiário: Letícia Khater
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto