Caracterização bioquimica e molecular do componente transcriptase reversa da telomerase de Leishmania spp

Autor(es)

Miriam Aparecida Giardini

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2007-06-14

Membros da banca

Maria Isabel Nogueira Cano; Celso Eduardo Benedetti; Otavio Henrique Thiemann; João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa; Marcia Regina Machado dos Santos

• Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano

Resumo

Telômeros são complexos DNA-proteínas que protegem os cromossomos eucarióticos da degradação, garantindo estabilidade genômica. As seqüências teloméricas são ricas em G e apresentam uma protrusão 3¿ simples-fita que se estende em direção ao terminal cromossômico. Em Leishmania, os telômeros são compostos pela seqüência repetida 5¿-TTAGGG-3¿ e são replicados pela telomerase, a principal responsável pela manutenção dos terminais cromossômicos em eucariotos. Além de replicar os telômeros, o complexo holoenzimático da telomerase, composto pela transcriptase reversa da telomerase (TERT), pelo RNA da telomerase (TER) e por proteínas associadas, também atua como parte de um complexo de ordem maior que protege os terminais teloméricos. O entendimento do mecanismo de regulação da manutenção telomérica será de grande valor científico e poderá levar ao descobrimento de algum alvo potencial para o desenvolvimento de novas drogas anti-leishmania. Com esse objetivo, identificamos, clonamos e caracterizamos o gene que codifica o componente TERT em Leishmania spp.. O alinhamento múltiplo das seqüências através do programa ClustalW demonstrou que as telomerases de Leishmania apresentam muito mais homologia entre si do que com as proteínas de outros kinetoplastídeos e eucariotos. Experimentos de caracterização indicaram que a seqüência putativa do gene da telomerase de Leishmania localiza-se provavelmente em cópia única nos maiores cromossomos. Um único transcrito de RNA mensageiro foi encontrado nos promastigotas. Análises filogenéticas sugeriram que a telomerase de Leishmania pode representar uma ligação entre os mais antigos e os mais novos ramos das telomerases. Além disso, proteínas recombinantes foram expressas em sistema bacteriano, tornando possível a produção de anticorpos policlonais em coelhos. Experimentos de ¿Western blotting¿ e imunoprecipitação de cromatina indicaram que o anticorpo foi capaz de reconhecer a proteína nativa e que a telomerase de L. amazonensis interage in vivo com a seqüência telomérica rica em G. A atividade de telomerase de L. amazonensis foi purificada utilizando-se uma combinação de colunas cromatográficas. Testou-se a atividade enzimática em cada passo da purificação utilizando-se o ensaio ¿Two-tube TRAP¿. Os resultados mostraram que a atividade enzimática é encontrada nas frações purificadas pelas cromatografias de troca iônica, de afinidade por Heparina e de gel filtração. A atividade foi altamente enriquecida após a purificação por afinidade utilizando um oligonucleotídeo de DNA telomérico rico em G. Quando foi utilizado um oligorribonucleotídeo 2¿O-metil complementar à putativa seqüência molde do TER de Leishmania como ligante na cromatografia de afinidade, pouca ou nenhuma atividade enzimática foi eluída da resina, sugerindo que a interação entre a telomerase de L. amazonensis e este oligorribonucleotídeo é tão forte que não permite sua dissociação nas condições de eluição gentis necessárias para manter a atividade enzimática. Formas procíclicas de Trypanosoma brucei foram utilizadas para a construção do sistema ¿PTP-tagging¿, no intuito de futuramente purificar o complexo holoenzimático da telomerase. Em paralelo, ensaios de ¿primer extension¿ foram padronizados e identificou-se uma seqüência candidata ao gene do RNA da telomerase de T. brucei. Também foi identificada e clonada em L. amazonensis, uma seqüência homóloga à PinX1 humana, descrita como uma proteína que interage diretamente com a TERT humana e considerada um inibidor natural da atividade de telomerase (AU)

• Processo FAPESP: 03/01783-7 - Caracterização bioquímica e molecular do componente transcriptase reversa da telomerase de Leishmania spp.
• Beneficiário: Miriam Aparecida Giardini
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto