Caracterização de uma cálcio ATPase PMR1 de \'Aspergillus fumigatus\'

Autor(es)

Frederico Marianetti Soriani

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2006-09-05

Membros da banca

Sergio Akira Uyemura; Maria Cristina Roque Antunes Barreira; Lucia Helena Faccioli; Joao Atilio Jorge; Claudia Maria Leite Maffei

• Orientador: Sergio Akira Uyemura

Resumo

Os conhecimentos sobre a regulação dos níveis de cálcio e manganês no Aspergillus fumigatus são bastante limitados, sendo que a homeostase destes íons pode ser diretamente controlada pela ação de ATPases específicas, dentre elas as cálcio ATPases da subfamília PMR1. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi a expressão, caracterização e validação como alvo quimioterapêutico do gene Afpmr1 de A. fumigatus. Inicialmente, foi realizada a complementação funcional, de uma cepa de S. cerevisiae nocaute para a PMR1, em meios de cultura suplementados com EGTA ou manganês, revertendo o fenótipo da cepa nocute. Além disto, após expressão do gene Afpmr1, foi verificada uma reversão na intensa distribuição de quitina na parede celular da cepa nocaute. Paralelamente, para a RNAi, um fragmento do gene Afpmr1 apresentando baixa identidade com outros genes de cálcio ATPases de diferentes espécies foi clonado em vetor de expressão em A. fumigatus (pALB1). Após indução da expressão, a construção de RNA dupla fita para RNAi silenciou tanto o gene alb1 isoladamente (clone controle), quanto o duplo silenciamento com o gene de interesse Afpmr1, conferindo à ambas construções coloração branca às colônias. Uma vez confirmado o silenciamento gênico, por técnicas de RT-PCR quantitativo, os clones selecionados foram utilizados em ensaios de fagocitose e killing de macrófagos. O clone com o gene Afpmr1 silenciado apresentou diminuição na porcentagem de fagocitose, no número médio de conídios fagocitados e na eficiência de eliminação destes conídios quando comparados com seus controles. Estes resultados mostram que o gene Afpmr1 pode ser expresso funcionalmente em sistemas heterólogos e seu silenciamento, em A. fumigatus, influencia processos celulares que podem estar relacionados à manutenção da estrutura e composição da parede celular, além de desencadear alterações na fagocitose e killing de macrófagos. (AU)

• Processo FAPESP: 02/09600-6 - Expressão e caracterização do gene de uma cálcio ATPase de Aspergillus fumigatus
• Beneficiário: Frederico Marianetti Soriani
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado