Caracterização funcional e estrutural de uma fosfolipase A2 ácida isolada do veneno de Bothrops pirajai

Autor(es)

Sabrina Schaaf Teixeira

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2009-03-04

Membros da banca

Andreimar Martins Soares; Renê de Oliveira Beleboni; Hosana Maria Debonsi

• Orientador: Andreimar Martins Soares

Resumo

A caracterização proteômica de venenos de serpentes contribui significativamente para o avanço das Ciências na área Biomédica. Várias destas moléculas, utilizadas como instrumentos de investigação de mecanismos celulares e moleculares, estão envolvidas em diversos processos fisiopatológicos e de intoxicação. No entanto, os venenos de serpentes ainda requerem caracterização funcional e/ou biológica adicionais. As fosfolipases A2s (PLA2s) são enzimas que induzem vários efeitos farmacológicos, e geralmente, correspondem a maior porcentagem do conteúdo protéico dos venenos de serpentes. Desta forma, o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de PLA2s poderão gerar informações importantes para o melhor entendimento dos efeitos farmacológicos e de intoxicação ocasionados por estas proteínas. Este trabalho descreve o isolamento e a caracterização bioquímica, enzimática, funcional e estrutural da primeira PLA2 Asp49 ácida, denominada Bpir-I-PLA2, isolada do veneno da serpente Bothrops pirajai, espécie endêmica da região Sul do Estado da Bahia e atualmente, integrante da Lista Nacional das Espécies da Fauna Brasileira Ameaçadas de Extinção. O isolamento da Bpir-I-PLA2 foi realizada através de dois passos cromatográficos, envolvendo inicialmente cromatografia de troca iônica, seguida de HPLC de fase reversa. Quanto submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida para proteínas ácidas, Bpir-I-PLA2 apresentou alto grau de homogeneidade. A massa molecular relativa, determinada através de eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante, foi de aproximadamente 28.000 para a forma de dímero e 14.500 para o monômero. A focalização isoelétrica demonstrou uma única banda para a fosfolipase A2, revelando pI aproximado de 4,9. A região N-terminal de Bpir-I-PLA2, seqüenciada através do método de degradação de Edman, apresentou elevada homologia entre outras PLA2s de venenos de serpentes. A composição de amioácidos da proteína corroborou com sua característica ácida, apresentando um elevado conteúdo de aminoácidos carregados negativamente. A enzima apresentou elevada atividade fosfolipásica e induziu edema moderado in vivo. Além disso, Bpir-I-PLA2 foi capaz de inibir a agregação plaquetária e a coagulação do plasma, e também induzir efeito hipotensor in vivo e citotóxico sobre células tumorais, bactérias, fungos e leishmanias. O tratamento da enzima com o reagente brometo de p-bromofenacila neutralizou as atividades enzimática, inibitória sobre a agregação plaquetária, anticoagulante, hipotensora e antitumoral. A moderada atividade edematogênica foi parcialmente inibida. O cDNA contendo 366 bp (BPIR-A) que codifica a proteína Bpir-I-PLA2 foi clonado e a proteína recombinante, expressa. Bpir-I-PLA2 recombinante apresentou a mesma sequência de aminoácidos, estrutura secundária, atividade fosfolipásica e efeito inibitório sobre plaquetas, observados para a proteína nativa Bpir-I-PLA2, sugerindo que a recPLA2 foi eficientemente expressa e purificada. Devido à baixa toxicidade demonstrada, a Bpir-I-PLA2 pode tornar-se uma ferramenta importante nos estudos das desordens da coagulação, como também um potencial modelo para a elaboração de novos fármacos para uso na clínica-médica. (AU)

• Processo FAPESP: 06/05304-4 - Caracterizacao funcional e estrutural de uma fosfolipase a2 acida isolada do veneno de bothrops pirajai: clonagem, expressao e sintese de peptideos.
• Beneficiário: Sabrina Schaaf Teixeira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado