Clonagem, expressão e estudo de especificidade das calicreínas teciduais humanas hK5 e hK7

Resumo

As calicreínas humanas hK5 e hK7 fazem parte de uma família de 15 serino-peptidases (hK1-hK15) que, à exceção de hK1, hK2 e hK3, foram recentemente identificadas e caracterizadas como calicreínas. Pouco se conhece sobre a especificidade dessas enzimas, mas alguns dados experimentais sugerem que hK5 e hK7 podem estar participando ativamente de processos fisiopatológicos relacionados à descamação da pele. Portanto, a caracterização de suas especificidades é crucial, não apenas para mapear os sítios de interação enzima/substrato, como também para o desenvolvimento de substratos e/ou inibidores específicos e/ou seletivos para ambas as enzimas. Pretende-se clonar e expressar hK5 e hK7 usando dois vetores de expressão, pET-28a(+) e pPIC9K. O primeiro vetor será usado para produzir as enzimas em células de E. coli, visando à produção de anticorpos monoclonais. As enzimas usadas no estudo de especificidade serão produzidas com o vetor pPIC9K em células de P. pastoris. A caracterização da especificidade das hK5 e hK7 será feita com o uso de peptídeos com supressão intramolecular de fluorescência, baseados na sequência de referência Abz-KLRSSKQEDDnp, que tem se mostrado eficiente no estudo de outras peptidases. Com os dados cinéticos obtidos a partir do estudo de especificidade, a pesquisa se empenhará no desenvolvimento de substratos fluorescentes seletivos e/ou específicos para as hK5 e hK7. Além disso, usando bibliotecas de inibidores de serino-peptidases, pretende-se buscar inibidores seletivos e/ou específicos para essas enzimas. (AU)