Avaliacao da fosfolipase a2 secretorias na infeccao experimental causada por leishmania (leishmania) amazonensis.

Resumo

Neste projeto pretende-se avaliar a ação de PLA2 secretórias isolada do veneno de C. d. collilineatus sobre a infecção da Leishmania (L) amazonensis in vivo. Inicialmente serão analisados os efeitos da crotoxina sobre o crescimento da promastigota de L. (L) amazonensis em comparação com outras frações presentes no veneno desta cascavel (convulxina, giroxina e crotamina), o monitoramento será feito através de contagem e pelo uso do MTS, verificação da viabilidade celular. As isoforrnas de PLA2 e crotapotina serão isoladas por técnicas em HPLC de fase reversa e a homogeneidade molecular destas isoformas será confirmado por técnicas de PAGE-SDS e espectrometria de massa e a atividade enzimática da PLA2 confirmada por ensaios cinéticos específicos. Também avaliaremos o efeito de ambas amostras sobre promastigotas de L. (L.) amazonensis, bem com os efeitos citotóxicos das PLA2 e Crtp sobre os macrófagos e sobre macrófagos infectados. O monitoramento da ação destas toxinas sobre o progresso da infecção será avaliado pela técnica ELISA in situ e o efeito das PLA2 sobre as promastigotas será avaliado por contagem e por visualização sob microscopia óptica. O sobrenadante das células infectadas será colhido e congelados para quantificação das interleucinas por ELISA de captura dando um enfoque especial as IL-2; IL-4; IL-12 e IFN-gamma. "ln vivo" pretendemos verificar o efeito destas proteínas sobre a infecção em camundongos BALB/c. onde a severidade da infecção será medida pelo tamanho da lesão, que também será submetida a análises histopatológicas. Na terceira etapa, pretendemos verificar a presença principalmente da PLA2 secretórias tanto no sobrenadante como no lisado de L. (L). amazonensis e avaliar os efeitos de inibidores específicos de PLA2 sobre a atividade enzimática in vitro, além disso, serão utilizadas outros inibidores específicos para as PLAZ citossólicas. Alem destes compostos examinaremos o efeito de inibidores do metabolismo do ácido araquidônico como a dexametasona e indometacina. Como último objetivo, comparar qualitativamente e quantitativamente os perfis protéicos presentes em formas metacíclicas de L.(L.) amazonensis, por técnicas analíticas e tentar caracterizar a presença de PLA2 destes parasitos. (AU)