Caracterizacao de uma putativa quinase dependente de ciclina e analise de sua possivel atuacao nos endociclos de rhynchosciara americana

Resumo

O presente trabalho tem como objetivo caracterizar um gene de uma putativa quinase dependente de cidina (similar a Cdc2/Cdk10) e analisar sua possível atuação nos endociclos de Rhynchosciara americana. Interessantemente um transcrito correspondente a este gene foi identificado em uma biblioteca de cDNA de glândulas salivares, a qual foi construída com mRNAs presentes durante o período em que ocorre o último ciclo replicativo da politenização e inicio da amplificação gênica de diferentes pufes de DNA. No entanto, ainda não foi descrita a participação de uma Cdc2/CDK10 em processos endoreplicativos nem foi identificada uma cidina reguladora em nenhum modelo biológico, o que torna este gene um candidato potencialmente interessante. A fim de caracterizar o putativo Cdc2/Cdk10 objetiva-se clonar a porção 5’ de seu mensageiro através de RACE e utilizar o cDNA completo como sonda para uma varredura de uma biblioteca genômica construída em fagos. O clone genômico será utilizado para localização cromossômica deste gene por meio de hibridização in situ fluorescente (FISH) e para seqüenciamento. O perfil de expressão será traçado por Real Time RT-PCR em glândula salivar e corpo gorduroso em diferentes fases do desenvolvimento e complementado por western blots com uso de anticorpo específico contra CDC2/CDK10 de Rhynchosciara. Possíveis indicações de suas funções durante endociclos seriam obtidas através de experimentos de silenciamento gênico por RNAi. A análise de imunoblots de eletroforese 2D de extratos celulares seria utilizada para determinar outras informações sobre CDC2/CDK10, tais como possíveis isoformas e modificações pós-traducionais em diferentes tecidos ou fases do desenvolvimento. (AU)