Peptídeos bioativos da laminina induzindo invadopódios em linhagem celular derivada de carcinoma epidermóide: estudo dinâmico por microscopia 4D

Resumo

Invadopódios são estruturas com papel fundamental na invasão e disseminação de tumores malignos. Caracterizam-se como protrusões citoplasmáticas ricas em actina e proteínas ligantes de actina. Além disso, essas protrusões possuem atividade de degradação da matriz peri-celular, mediada por metaloproteinases da matriz (MMPs). Nesse projeto estudaremos a dinâmica de formação de invadopódios em linhagem celular derivada de carcinoma epidermóide oral (células OSCC) tratada por peptídeos bioativos da laminina. Dados de nosso Laboratório já demonstraram que peptídeos da laminina estão envolvidos com migração, invasão e atividade de protease em células tumorais (Freitas et al., 2004; Freitas et al., 2007; Morais Freitas et al., 2007; Gama-de-Souza, 2008; Gama-de-Souza et al., 2008; Siqueira et al., 2009). Em uma primeira etapa, células OSCC serão tratadas por peptídeos da laminina e crescidas sobre substrato fluorescente. O crescimento celular sobre esse substrato determina focos de digestão que caracterizam atividade funcional de invadopódios. Contagem do número de focos de digestão e/ou mensuração da área dos mesmos mostrará se determinado peptídeo da laminina induziu aumento da atividade de invadopódios. A dinâmica de formação dessas estruturas em carcinoma epidermóide será observada em microscopia 4D. Células OSCC serão transfectadas com plasmídeos codificando diferentes proteínas fluorescentes de invadopódios, e em seguida serão crescidas sobre substrato fluorescente e tratadas por peptídeos da laminina. Secções ópticas no eixo Z serão obtidas em diferentes intervalos de tempo, para análise espacial e temporal da estruturação de invadopódios eventualmente induzidos por peptídeos da laminina. Além disso, reconstrução tri-dimensional e renderização volumétrica trarão importantes informações sobre a relação invadopódio-substrato. Nas etapas subsequentes, estudaremos receptores e vias de sinalização envolvidos na dinâmica de formação de invadopódios. Para estudo dos receptores utilizaremos RNA de interferência para silenciar a expressão de integrinas e sindecan-1, seguido de estímulo por peptídeos da laminina, crescimento em substrato fluorescente e estudo em microscopia 4D. Para análise das vias de sinalização utilizaremos inibidores específicos, e submeteremos as células às mesmas condições descritas acima. (AU)