Dinamica de formacao de invadopodios em linhagens tumorais tratadas por peptideos bioativos da laminina. estudo por microscopia 4d

Resumo

Invadopódios são estruturas com papel fundamental na invasão e disseminação de tumores malignos. Caracterizam-se como protrusões citoplasmáticas ricas em actina e proteínas ligantes de actina. Além disso, essas protrusões possuem atividade de degradação da matriz peri-celular mediadas por metaloproteinases da matriz (MMPs). Nesse projeto estudaremos por microscopia 4D a dinâmica de formação de invadopódios em linhagens tumorais tratadas por peptídeos bioativos da laminina. Tal tipo de estudo se justifica, uma vez que já demonstramos que peptídeos bioativos da laminina, como YIGSR, SIKVAV, AG73 e C16, estão envolvidos com migração, invasão e atividade de protease em células tumorais (Freitas et al. 2004; Freitas et al. 2007; Morais Freitas et al. 2007; Gama-de-Souza et al. 2008; Gama-de-Souza et al. 2008 ). Linhagens tumorais serão tratadas por peptídeos da laminina e crescidas sobre substrato fluorescente (gelatina ou Matrigel). O crescimento celular sobre esses substratos determina focos de digestão que caracterizam atividade funcional de invadopódios. Contagem do número de focos de digestão, bem como mensuração da área dos mesmos, mostrará se determinado peptídeo da laminina induziu aumento da atividade de invadopódios. A dinâmica de formação dessas estruturas em linhagens tratadas pelos peptídeos da laminina será observada em microscopia 4D. Células tumorais tratadas e controles serão transfectadas com plasmideos codificando diferentes proteínas fluorescentes de invadopódios, como actina "mCherry" e cortactina-GFP. Em seguida, essas células serão crescidas sobre substrato fluorescente. Secções ópticas no eixo Z serão obtidas em diferentes intervalos de tempo, para análise espacial e temporal da estruturação de invadopódios eventualmente induzidos por peptídeos da laminina. Além disso, reconstrução tridimensional e renderização volumétrica trará importantes informações sobre a relação invadopódio-substrato nas linhagens tumorais. Finalizando estudaremos receptores e vias de sinalização envolvidos na dinâmica de formação de invadopódios em linhagens tratadas pelos peptídeos da laminina. Para estudo dos receptores utilizaremos RNAi para silenciar a expressão de integrinas e sindecan-1, seguido de estímulo por peptídeos da laminina, crescimento em substrato fluorescente e estudo em microscopia 4D. Para estudo das vias de sinalização utilizaremos inibidores específicos, seguido de estímulo por peptídeos da laminina, crescimento em substrato fluorescente e estudo em microscopia 4D. (AU)