Obtenção e utilização de vetor viral SFV expressando GFP e RVGP

Resumo

A utilização do Semliki Forest Virus (SFV) para fins de produção de proteínas recombinantes em células de mamíferos infectadas ou para fins terapêuticos e vacinais vem sendo cada vez mais estudada. A obtenção e utilização desse vetor viral requerem a execução de diversas etapas de biologia molecular e de cultivo de células. Com o objetivo de estabelecer e padronizar essas diferentes metodologias, utilizaremos um vetor capaz de expressar o gene da proteína verde fluorescente (GFP). O SFV-GFP, quando obtido por metodologia padronizada, será utilizado para desenvolver a RT-PCR quantitativa como método inovador para a titulação viral, por meio da correlação entre seus resultados e os resultados de infecção in vitro medidos por citometria de fluxo. Serão estabelecidos parâmetros para o estudo da melhor relação entre as quantidades de vírus / células (multiplicidade de infecção- moi) e quanto ao tempo e à temperatura de infecção mais adequados à expressão recombinante. Será determinada a relação entre título viral e a produção da proteína recombinante em condições padronizadas, comparando os vetores SFV-GFP e SFV carregando o gene da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP), os (SFV-RVGP). Com o SFV-RVGP produzidos, caracterizados e quantificados pretendemos ainda estudar as diferenças da resposta imunológica em camundongos imunizados com este vetor viral onde a produção da RVGP ocorre in vivo, com a resposta em camundongos imunizados com a RVGP produzida in vitro em células de mamíferos.