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Obtenção e utilização do vetor viral SFV expressando GFP.

Texto completo
Autor(es):
Ana Lia Pradella Puglia
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
Imprenta: São Paulo.
Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Ciências Biomédicas (ICB/SDI)
Data de defesa:
Membros da banca:
Renato Mancini Astray; Ronaldo Zucatelli Mendonça; Jaime Henrique Amorim Santos
Orientador: Renato Mancini Astray
Resumo

O Semliki Forest Vírus recombinante (rSFV) vem sendo apontado como um dos vetores virais mais promissores, tanto para a expressão de proteínas de interesse biotecnológico, como para a utilização como vetor vacinal. Neste trabalho obtivemos um rSFV carregando o gene da proteína verde fluorescente GFP (rSFV-GFP), que foi utilizado para a padronização de métodos de obtenção do vetor viral e de sua titulação, duas etapas importantes para os trabalhos que utilizam rSFVs. Por meio da análise da expressão da GFP em células BHK-21 infectadas por lotes de vírus obtidos por um reagente de transfecção lipídico ou por eletroporação, estabelecemos as melhores condições de obtenção dos rSFV e de sua utilização para a infecção e produção de proteínas recombinantes de interesse. Além disso, padronizamos criteriosamente uma metodologia de RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) absoluta, baseada em uma curva padrão, para realizar a titulação de partículas rSFV, independentemente do gene heterólogo clonado. A análise direta da quantidade de células infectadas, por citometria de fluxo e por microscopia de fluorescência, fez do rSFV-GFP a ferramenta adequada para nossos estudos de titulação viral por qRT-PCR. Foi demonstrada a associação entre o número de cópias do RNA viral utilizado para a infecção das células e a quantidade de células expressando GFP. Essa abordagem levou ao desenvolvimento de competências técnica e tecnológica (construção, avaliação e titulação) que facilitarão a obtenção de outros rSFV de interesse. Concluímos que a eletroporação é o melhor método de obtenção das partículas e que o título viral, determinado por qRT-PCR, pode ser utilizado para calcular o volume de um lote de rSFV necessário para obter a multiplicidade de infeção desejada. (AU)

Processo FAPESP: 11/15269-0 - Obtenção e utilização de vetor viral SFV expressando GFP e RVGP
Beneficiário:Ana Lia Pradella Puglia
Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado