Validação de um ensaio imunocromatográfico para o diagnóstico de Escherichia coli diarreiogênica

Resumo

Infecções diarreicas agudas ainda são apontadas como significante causa de morbidade e mortalidade, principalmente em países em desenvolvimento. Anualmente, aproximadamente 1,5 milhões de mortes associadas à diarreia são estimadas e cerca de 2 bilhões de casos de doenças diarreicas, concentradas na maioria em áreas empobrecidas do mundo. Dentre os patógenos causadores de diarreia as Escherichia coli diarreiogênicas são responsáveis por 30 a 40% dos episódios de diarreia aguda nesses países. Neste contexto, o diagnóstico é uma importante ferramenta para minimizar e controlar ocorrências. Dentre as E. coli diarreiogênicas, as categorias de relevada importância epidemiológica são: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC) e E. coli produtora da toxina de Shiga (STEC) e seu subgrupo E. coli enterohemorrágica (EHEC). Com exceção de EAEC que não apresenta um fator de virulência comum a todos os isolados, os outros três patótipos produzem fatores de virulência que servem de alvo para o seu diagnóstico, assim EPEC e EHEC expressam intimina e proteínas secretadas (Esps),ETEC apresenta como principais fatores de virulência a produção das toxinas termoestável(ST) e termo lábil (LT) e as potentes citotoxinas de Shiga (Stx1 e/ou Stx2) são secretadas por STEC e EHEC. Comparando-se os métodos de detecção, os ensaios imunossorológicos apresentam diversas vantagens para testes rápidos, incluindo altaespecificidade, sensibilidade, fácil preparação da amostra e fácil execução. Assim, a utilização de anticorpos policlonal e monoclonal (MAb) nos levou a padronização de um método de captura prático, rápido e com baixo custo para detecção dos fatores de virulência de ETEC, EPEC e STEC/EHEC em isolados bacterianos. Todos osanticorpos foram obtidos no Laboratório de Bacteriologia; a saber os anticorposmonoclonais e policlonais anti-ST, anti-LT, anti-Stx1, anti-Stx2 e anti-EspB. Após obtenção, purificação e caracterização de todos os anticorpos, o teste imunocromatográfico (IC) foi escolhido por ser um método que atenderá o nossoobjetivo. Basicamente, a fita do teste é composta por três tipos de membranas: fibra de celulose [sample pad e absorbing pad" (Millipore®)], fibra de vidro [conjugate pad(Millipore®)] e nitrocelulose [nitrocellulose HiFlow (Millipore®)]. Após disposta, a fita permite que a amostra presente no sample pad migre e reaja com o MAb conjugado ao ouro coloidal. O complexo segue migrando pela fita e é capturado pelos anticorpos policlonais previamente imobilizados, gerando uma linha colorida, avermelhada. A reação é considerada positiva quando as duas linhas, teste e controle positivo, apresentam-se coloridas. Os anticorpos monoclonais foram conjugados ao ouro coloidal para avaliação das diferentes concentrações dos anticorpos policlonais. Quando essas condições foram estabelecidas, os limites de detecção utilizando os antígenos alvos foram avaliados e o ensaio imunocromatográfico apresentou uma reação positiva após 15 minutos. Esses resultados nos levam ao objetivo do presente projeto que consiste na determinação da sensibilidade, especificidade e eficiência deste ensaio imunocromatográfico utilizando isolados caracterizados como E. coli diarreiogênicas para definição da sensibilidade e de isolados bacterianos de microbiota e outras enterobactérias para definição da especificidade do ensaio.