Mecanismos moleculares envolvidos na modulação da função de AT1R por ATRAP e suas proteínas associadas e a repercussão sobre o transporte de íons em túbulos renais

Resumo

A ativação de AT1R por AngII induz complexos mecanismos de sinalização intracelular que resultam em aumento da reabsorção de NaCl e H2O ao longo do néfron, efeito importante no desenvolvimento e manutenção da hipertensão arterial. Este projeto tem como objetivo elucidar novos aspectos do funcionamento do receptor tipo 1 para angiotensina II (AT1R), com interesse especial na associação AT1R/ATRAP (AT1R Associated Protein). ATRAP tem sido considerada um regulador negativo de AT1R em células musculares lisas de vasos, em cardiomiócitos e, possivelmente, em rins. Pretendemos investigar o efeito da interação AT1R/ATRAP sobre as vias de sinalização ativadas por AngII/AT1R, dependentes e independentes de proteínas G, na linhagem celular de túbulos proximais renais de opossum, OKP, usando hiperexpressão ou knockdown de ATRAP. Uma vez que o permutador Na+/H+ NHE3 é a principal via de reabsorção de Na+ em túbulos proximais, iremos analisar a expressão e a atividade desse transportador em resposta a AngII em células com hiper ou hipoexpressão de ATRAP. Em células HEK293, pretendemos investigar a interferência de ATRAP na associação do AT1R com ²-arrestinas 1 e 2, com Rab5, Rab4, Rab11 e com Hsc70, assim como na internalização e degradação do receptor AT1.Uma importante via de sinalização regulada negativamente por ATRAP é a via AngII-AT1R/calcineurina/NFAT, assim, iremos investigar o efeito de ATRAP e CAML (Ca2+ modulating cyclophilin ligand), uma proteína que interage com ATRAP, sobre a alteração dos níveis intracelulares de Ca2+ mediada por ativação de canais para Ca2+ ativados por depleção dos estoques intracelulares de Ca2+ (SOC - Store Operated Channel ou ORAI). Iremos investigar a possível interação de CAML com o complexo Orai-STIM1-RACK1 e a interferência de ATRAP com essa interação.AngII é também um importante regulador do transporte iônico em túbulos convolutos distais (DCT), e a hiperexpressão de ATRAP em TCD atenua a hipertensão arterial induzida por AngII. Por outro lado, inibidores da calcineurina, como a ciclosporina A (CsA), induzem hipertensão e hipercalemia, que é revertida por diuréticos tiazídicos, mesmas manisfestações observadas em pacientes com mutação no gene WNK4. WNK4 é uma cinase chave na modulação do transporte em TCD e sua expressão mostra-se aumentada nesse segmento tubular tanto no tratamento com AngII como com CsA. Por isso, iremos investigar os mecanismos pelos quais AngII e CsA modulam a expressão de WNK4, assim como o papel de ATRAP nesses mecanismos regulatórios.Os métodos que pretendemos utilizar são: clonagem e expressão de proteínas de fusão recombinantes, siRNA, medida de pH e Ca2+ intracelulares com sondas fluorescentes, BRET e FRET para análise de interação entre proteínas e avaliação dos níveis de PIP2 na membrana plasmática, imunoprecipitação, immuno-blotting e microscopia confocal. (AU)