Produção e caracterização de células multipotentes e pluripontentes induzidas em Blastocerus dichotomus

Resumo

A criopreservação de gametas e embriões é de extrema importância para a manutenção de diversidade genética em pequenas populações selvagens, porém estes materiais são de difícil obtenção. Estudos realizados com células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) humanas e de camundongo mostraram-se capazes de se diferenciar em células germinais, espermatozoides e oócitos. Estudos sobre iPS em cervídeos são inéditos, logo temos como enfoque neste projeto estabelecer protocolos para a obtenção de linhagens iPS estáveis na espécie Blastocerus dichotomus para produzir gametas viáveis no futuro. A reprogramação de células somáticas em células iPS é facilitado pelo uso de células-tronco adultas e, como pouco se conhece a respeito de células-tronco multipotentes em cervídeos, a primeira fase do projeto tem como objetivo obter biopsias de diversos tecidos (adiposo, polpa dentária, botão do chifre), que serão comparadas com linhas celulares unipotentes oriundas de biopsias de pele (controle negativo). Será avaliada a viabilidade das células com azul de tripan, e marcadores de células mesenquimais serão avaliados por meio de RT-qPCR. Posteriormente, estes tecidos serão criopreservadas e sua viabilidade testada na pós-descongelação. A segunda fase terá como enfoque a derivação de células iPS a partir das linhagens multipotentes da fase anterior, que será conduzida por meio de transdução gênica utilizando-se a ferramenta PiggyBac. Os cultivos para derivação das iPS serão feitos em presença de fibroblasto fetais de camundongo (MEF) bloqueados pela mitomicina, e as colônias selecionadas serão repicadas para manter linhagens para posterior caracterização por meio de testes imunocitoquímicos, RT-qPCR, atividade da fosfatase alcalina, corante lacZ, cariótipo, capacidade de formar corpos embrióides in vitro, diferenciação em células da linhagem germinativa de fêmeas, avaliação de marcadores dos tecidos oriundos dos três folhetos embrionários, e diferenciação in vitro em camundongos imunosuprimidos para avaliar a formação do três folhetos embrionários.