Caracterização funcional e estrutural de AfPrxA, uma tiol peroxidase do fungo patógeno humano Aspergillus fumigatus e um potencial alvo para desenvolvimento de droga

Resumo

Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso saprófito e largamente distribuído no ambiente, responsável por diversas doenças respiratórias humanas, como Aspergilose Invasiva Pulmonar (AIP). AIP ocorre com alta frequência e gravidade em indivíduos imuno-comprometidos, sendo uma importante causa de mortalidade nestes pacientes. A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS = Reactive Oxygen Species), incluindo H2O2 e peróxidos orgânicos é uma das respostas do hospedeiro contra ataques de patógenos. Desta forma, mecanismos de defesa antioxidantes são importantes para a sobrevivência dos patógenos no hospedeiro. Dentre as frentes de defesa estão as enzimas antioxidantes, como as catalases, Glutationa Peroxidases (GPx) e Peroxirredoxinas (Prx). Além de H2O2, as Prx são uma família de enzimas capazes de rapidamente decompor hidroperóxidos de lipídeos e peroxinitrito e, portanto, são consideradas muito importantes para a sobrevivência do patógeno no hospedeiro. Para decompor peróxidos, as Prx utilizam cisteínas presentes em um motivo até então considerado universalmente conservado na família: Pro-X-X-X-Thr/Ser-X-X-Cys. Os resíduos Thr/Ser e Cys, juntamente com uma Arg conservada, constituem a tríade catalítica, a qual está envolvida na estabilização do estado de transição de uma reação de substituição nucleofílica do tipo SN2. As Prx podem ser classificadas de acordo com o número de cisteínas presentes em seu sítio ativo, podendo ser 1-Cys Prx ou 2-Cys Prx (com uma ou duas cisteínas envolvidas na catálise, respectivamente). Durante minha iniciação científica, estudei a proteína AfPrxA, que é uma Prx de Aspergillus fumigatus. Entre outros aspectos, mostrei que se trata de uma 1-Cys Prx que possui extraordinária reatividade com H2O2 (constante de segunda ordem na ordem de 107 M-1.s-1). Por outro lado, alinhamentos das sequências de aminoácidos revelaram que AfPrxA possui características estruturais únicas, como a substituição do motivo altamente conservado entre as Prx para Ser-X-X-X-His-X-X-Cys. Este projeto tem como objetivo a elucidação da importância destes resíduos modificados para a atividade de AfPrxA. Serão realizados ensaios enzimáticos com mutantes de His e Ser e cristalização da proteína selvagem pré-tratada com agentes redutores e oxidantes. A obtenção da estrutura cristalográfica desta proteína pode auxiliar na criação de novas abordagens de tratamentos às doenças causadas por A. fumigatus uma vez que apresenta baixa identidade com as Prx de humano (41%). Pretendemos também expressar o gene de AfPrxA em Saccharomyces cerevisiae. Como possuímos uma coleção de mutantes dessa levedura, e como o fenótipo de vários mutantes de peroxirredoxinas já estão caracterizados, será possível analisar em quais mutantes a expressão do gene de AfPrxA poderá resultar em complementação. Adicionalmente, ensaios a fim de elucidar se AfPrxA está envolvida na virulência de A. fumigatus serão realizados através de infecção de macrófagos J774 com as linhagens selvagem, AfPrxA ou AfPrxAC28S, analisando-se comparativamente a morte dos macrófagos, o nível de secreção de TNF-± e o estado oxidativo dos macrófagos. Também pretendemos utilizar as linhagens de A. fumigatus selvagem, AfPrxA ou AfPrxAC28S para avaliar a patogenicidade de AfPrxA em camundongos. (AU)