Mecanismos intracelulares induzidos por leucotrienos durante a diferenciação osteogênica

Resumo

O metabolismo ósseo é regulado por diversos mecanismos desencadeados pela interação entre moléculas locais e sistêmicas, onde hormônios, citocinas e mediadores lipídicos atuam de maneira autócrina, parácrina e endócrina. É conhecido na literatura que processos inflamatórios regidos por mediadores específicos no microambiente ósseo são capazes de modular a osteoclastogênese e, portanto, o metabolismo ósseo. Os leucotrienos (LTs) são mediadores inflamatórios sintetizados por osteoblastos e osteoclastos e sinalizam por meio de receptores do tipo transmembrana acoplados a proteína G. Existem quatro tipos de receptores: BLT1, BLT2 e cisLT1, cisLT2. O leucotrieno B4 (LTB4) agem nos receptores BLT1 ou BLT2 enquanto os cistenil-leucotrienos, que compreendem o LTC4, LTD4 e LTE4, agem nos receptores cisLT1 ou cisLT2. De maneira geral, esses receptores são acoplados às subunidades G±i e G±q, cuja ativação leva à inibição da adenilato ciclase e ao aumento do influxo de cálcio, respectivamente. No entanto, ainda não se sabe o impacto desses mediadores produzidos endogenamente na indução e/ou inibição da diferenciação osteogênica, bem como os mecanismos intracelulares e a expressão de microRNAs induzidos durante a diferenciação osteogênica. Assim, em células MC3T3-E1 cultivadas em meio osteogênico, pretendemos quantificar LTB4 e LTD4 e avaliar por RT-PCR a expressão da enzima 5-lipoxigenase (5-LO), responsável pela síntese de LTs, fosfatase alcalina (FAL), Runx-2 e osterix na presença ou não do inibidor da síntese de LTs (o composto MK 886), ou dos antagonistas dos receptores BLT1/2 e cisLT1/2. A seguir, a interação com receptores específicos e a sinalização intracelular induzida por LTB4 e LTD4 exógenos será determinada pela quantificação dos 2º mensageiros AMPc e cálcio intracelular na presença ou não do inibidor da síntese de LTs (o composto MK 886), ou dos antagonistas dos receptores BLT1/2 e cisLT1/2. Além disso, iremos avaliar o perfil da expressão de microRNAs induzidos por LTB4 e LTD4 durante diferenciação osteogênica. A seguir, iremos investigar a contribuição dos LTs sintetizados pelos pré-osteoblastos em diferenciação na indução da osteoclastogênese in vitro a partir de células tronco-hematopoiéticas, utilizando meio condicionado.