O sistema renina-angiotensina local em glândulas salivares de rato: alterações medicamentosas

Resumo

A descrição do Sistema Renina-Angiotensina (SRA) permite-nos compreender a atuação dos seus componentes na regulação da homeostase corpórea envolvendo principalmente a vasodilatação, consumo de água e controle hidrossalino. Quando esses componentes são produzidos pelas próprias células de um tecido, caracteriza-se o SRA local. Pesquisas recentes em nosso laboratório relataram a presença deste sistema nas glândulas parótidas, submandibulares e sublinguais de rato. Especificamente, encontramos angiotensinogênio, ECA, ECA2, AT1a, AT2 e MAS em todas as glândulas salivares e o receptor AT1b foi encontrado apenas na glândula parótida. O objetivo do presente estudo é comparar expressão dos componentes do SRA local nas glândulas salivares maiores de 3 grupos com 7 ratos cada, aos quais serão individualmente administrados, via intraperitoneal, durante 7 dias: 1) solução salina (veículo; grupo controle); 2) um agonista de receptor ²-adrenérgico (Isoproterenol - IPR; 20 mg/kg); 3) um bloqueador do receptor AT1 para Angiotensina II (Losartan; 10 mg/kg ). Para tal finalidade, serão realizadas as técnicas de reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), imunoistoquímica bem como análise proteômica e peptidômica. Serão utilizados ratos Wistar com 60 dias de vida. Para a qPCR, as glândulas parótidas, submandibulares e sublinguais de cada rato serão devidamente coletadas e armazenadas em uma solução estabilizadora de RNA e armazenadas em freezer a -80oC. Em seguida, a partir de protocolos dos fabricantes, serão realizadas as seguintes etapas: extração, quantificação e qualificação do RNA; realização da transcrição reversa e realização da qPCR para os diferentes alvos do SRA. Para o estabelecimento das expressões relativas de cada gene, em relação à expressão do gene beta actina (gene de referência), será feita a subtração do Ct (ciclo limiar) do alvo em estudo do Ct da beta actina (”Ct), sendo utilizada a fórmula 2- ”Ct para os cálculos de quantificação relativa. Para a imunomarcação, serão preparadas lâminas histológicas obtidas por meio de cortes de 5 µm de espessura de blocos de parafina em micrótomo rotatório. Serão feitos cortes mésio-distais, aderidos a lâminas de vidro comuns para microscopia, e então corados com hematoxicilina e eosina para a análise morfométrica, e lâminas silanizadas serão marcadas com os anticorpos primários para: Renina, ECA, ECA2 e dos receptores AT1, AT2 e MAS. Para a análise proteômica e peptidômica dos componentes do SRA das glândulas salivares, as moléculas de interesse dos tecidos serão extraídas e digeridas, submetidas à nanocromatografia líquida de alta performance, interligada a um espectômetro de massa. A identificação, caracterização e quantificação das moléculas dar-se-á por análise em banco de dados de proteínas humanas e algoritmos de software específico. Os resultados serão expressos como média ± desvio-padrão. Os dados serão comparados usando-se o teste de ANOVA entre os grupos e as diferenças serão identificadas pelo pós-teste de Bonferroni, adotando-se o nível de significância de p<0,05.