Intensificação e integração de processos de produção e purificação de proteína A de superfície de pneumococo

Resumo

A bactéria Escherichia coli é um dos principais hospedeiros empregados na produção de proteínas recombinantes, movimentando um mercado global de E50-60 bilhões em biofarmacêuticos. A escolha desta bactéria como fábrica microbiana se deve ao vasto conhecimento acumulado sobre a genética e o metabolismo da mesma, à disponibilidade de métodos precisos e rápidos para a modificação de seu genoma e à facilidade de obtenção de elevadas quantidades de biomassa utilizando protocolos de cultivo bem estabelecidos. Vetores de expressão muito difundidos para a produção de proteínas recombinantes em E. coli são baseados no operon lac, onde lactose e/ou seu análogo, o isopropil beta-D-1-tiogalactopiranosidio (IPTG), são utilizados para a indução da produção da proteína de interesse, que geralmente se acumula no interior da célula. A purificação da proteína de interesse é geralmente facilitada por ser produzida em fusão com elementos (cauda de histidinas, dentre outros) que conferem afinidade por íons de metais de transição (Ni+2, Co+2, Zn+2), permitindo a obtenção do produto puro por cromatografia de afinidade. Porém, é necessário remover esses elementos que facilitam a purificação do produto final, com aumento do custo devido ao preço elevado das enzimas e das etapas subsequentes exigidas para separação da molécula livre da fusão. Para proteínas produzidas sem fusão, a estratégia de purificação deve ser desenvolvida com base nas diferenças entre as características físico-químicas da molécula de interesse e dos contaminantes (como proteínas, DNA e lipopolissacarídeos ou endotoxinas) e, neste caso, os protocolos podem ser extremamente variados. A presença de contaminantes no produto de interesse obtido ao final da etapa de produção está diretamente relacionada com as estratégias de cultivo e indução empregadas. Por isso, é fundamental identificar as respostas fisiológicas das células à indução e, principalmente incorporar essa questão no desenvolvimento de estratégias de cultivo. Além disso, a produção de medicamentos mais acessíveis e com qualidade superior depende do aprimoramento simultâneo dos processos upstream e downstream e da incorporação da análise da viabilidade econômica dos processos integrados. O principal objetivo deste projeto de pesquisa é intensificar, integrar e otimizar economicamente os processos de produção e purificação da proteína A de superfície do pneumococo (PspA), a qual poderá ser empregada na forma de vacina conjugada ou como vacina proteica de subunidade, para prevenção de infecções causadas por Streptococcus pneumoniae. A partir de cultivos em biorreator de bancada (convencional e airlift operado em sobrepressão) conduzidos em batelada, utilizando diferentes meios de cultivo (complexo e mínimo), indutores (IPTG e lactose) e temperaturas de indução serão obtidas diferentes biomassas de rE. coli BL21( (usual e detoxificada) contendo a proteína alvo, as quais serão processadas no Instituto Butantan para testar diferentes protocolos de purificação. Os protocolos de purificação que apresentarem o desempenho satisfatório em termos de pureza e qualidade juntamente com as respectivas condições de cultivo-indução serão integrados e analisados quanto à viabilidade econômica via a "Biorrefinaria Virtual da Proteína Recombinante" (BVPR), a qual será implementada no software livre EMSO (Environment for Modelling, Simulation and Optimization). A partir da avaliação dos resultados obtidos em termos de pureza e rendimento em proteína recombinante em todas as combinações de processos de produção/purificação estudados e da análise de viabilidade econômica fornecida pela BVPR, a estratégia de cultivo e de purificação mais eficientes do ponto de vista econômico e da qualidade do produto será identificada e escalonada para cultivo de alta densidade celular em batelada alimentada. (AU)