Influência dos hormônios do estresse sobre a resistência das células do câncer de boca ao tratamento quimioterápico

Resumo

Estudos recentes têm demonstrado que a norepinefrina (NE) exerce influência fundamental no processo de resistência de alguns tipos de câncer ao tratamento quimioterápico. Este tema, porém, permanece pouco explorado e ainda não foi investigado no câncer de boca. Desta forma, o objetivo deste trabalho é o de investigar os efeitos e os mecanismos envolvidos na ação da NE sobre a resistência das células do câncer de boca ao tratamento quimioterápico in vitro. Três linhagens de carcinoma espinocelular de boca (CEC), SCC-9, SCC-15 e Cal27, serão estimuladas com 10¼M de NE uma hora antes do tratamento com os quimioterápicos cisplatina e 5-fluorouracil, individualmente. Vinte e quatro horas depois, a viabilidade celular será checada por meio do MTT e do alamar blue. Em seguida, dois mecanismos possivelmente responsáveis pela quimiorresistência do CEC de boca induzida pelo NE serão investigados: a participação das proteínas MDR-1 e ABCG2 no efluxo dos fármacos para o exterior da célula e o papel das células-tronco tumorais na manutenção e propagação da população tumoral resistente. Para estudo do primeiro mecanismo, as expressões gênica e proteica do MDR-1 e ABCG2 serão verificadas em células estimuladas ou não com a NE e tratadas com os quimioterápicos por meio do qRT-PCR e western blotting, respectivamente. Para confirmar o papel das referidas proteínas, será realizada a interferência do RNA do MDR-1 e do ABCG2, individualmente, e a viabilidade celular e as expressões gênicas e proteicas serão novamente verificadas. Para investigar o segundo mecanismo, as células de CEC de boca quimiorresistentes estimuladas ou não pela NE serão caracterizadas através da verificação da atividade do ALDH, da identificação das side populations por meio ensaio de exclusão do corante Hoechst 33342 e da imunomarcação de proteínas de superfície CD44 e CD133. Ademais, será analisada a capacidade da formação de esferas tumorais destas células quando cultivadas em baixa densidade e em placas com superfície de baixíssima aderência. Por fim, para verificar a capacidade migratória e invasiva das células de CEC de boca estimuladas ou não com a NE e posteriormente tratadas com os quimioterápicos, os ensaios de migração celular por cicatrização e o ensaio de invasão celular transwell serão realizados. Os dados dos experimentos da cultura de células serão submetidos à análise de variância (ANOVA) ou teste "t" de student. Dados da análise quantitativa do qRT-PCR serão apresentados na quantidade de vezes a expressão do gene alvo aumentou ou diminuiu em relação ao controle (células não tratadas). Nível de significância de 5% será adotado para todos os testes. As expressões protéicas exibidas pelo western blotting serão analisadas qualitativamente. (AU)