Caracterização do perfil de expressão do RNAm BhC4-1-LacZ em embriões de linhagens das séries (-824/-187), (-488/-187) e (-850/+40) de D. melanogaster.

Resumo

O gene BhC4-1 do pufe de DNA C4 de Bradysia hygida é amplificado e expresso de modo regulado no desenvolvimento em dois tecidos larvais, a glândula salivar e glândula protorácica. Estudos funcionais realizados em D. melanogaster revelaram que os mecanismos reguladores da expressão do gene BhC4-1 encontram-se conservados em D. melanogaster e resultaram na identificação de módulos cis-reguladores que regulam a expressão deste gene de sciarídeo. Dentre os módulos identificados, o módulo (-253/-187) regula a expressão de BhC4-1-lacZ na glândula anelar a partir de embriões tardios, enquanto que o módulo cis-repressor distal (-3314/-1294) reprime a expressão de BhC4-1-lacZ na glândula anelar em tempos anteriores à pré-pupas 0h e o módulo cis-repressor proximal (-1293/-254) reprime a expressão de BhC4-1-lacZ na glândula anelar em tempos anteriores ao segundo instar larval. Em nosso laboratório foram geradas linhagens transformadas com as construções (-824/-187) e (-488/-187), desenhadas para estender a caracterização funcional do módulo repressor proximal. Nestas linhagens o módulo ativador de glândula anelar (-253/-187) encontra-se à jusante dos fragmentos (-824/-254) ou (-488/-254) e a expressão do repórter ocorre tanto na glândula anelar a partir do segundo instar larval (L2), como ectopicamente em células da epiderme de embriões. Os níveis de expressão ectópica da proteína repórter na epiderme de embriões parecem ser maiores nas linhagens das séries (-824/-187) e (-488/-187) quando comparado ao observado em linhagens da série (-850/+40), o que pode estar indicando a existência de um módulo repressor do padrão de expressão ectópico no fragmento (-186/+40). Este conjunto de linhagens foi analisado apenas quanto ao padrão de expressão da proteína repórter. O presente projeto pretende refinar a caracterização do padrão de expressão do transgene nas linhagens das séries (-824/-187), (-488/-187) e (-850/+40), através da investigação do padrão de expressão do RNAm BhC4-1-lacZ empregando experimentos de hibridação in situ. Com estes experimentos será possível comparar os níveis de expressão do RNAm do transgene nas células da epiderme de embriões nas linhagens (-824/-187) com o observado nas linhagens (-850/+40), o que permitirá confirmar a existência de módulos cis-repressores da expressão ectópica no fragmento (-186/+40). Em conjunto, os experimentos aqui propostos são uma etapa importante na caracterização do promotor de BhC4-1, servirão como ponto de partida para o desenho de experimentos futuros e contribuirão com informações acerca de módulos cis-reguladores presentes em um promotor de eucarioto.