Construção de vetor para expressão do sistema CRISPR/Cas9 em E. coli-Rhodococcus visando acúmulo de ácido ferúlico em mutantes de Rhodococcus jostii RHA1

Resumo

A biomassa lignocelulósica, um recurso abundante e de baixo custo, representa uma potencial alternativa ao petróleo para conversão em combustíveis e aditivos químicos. Até um terço da lignocelulose é composto de lignina, um polímero aromático altamente recalcitrante, que é atualmente queimado para produção de energia elétrica ou descartado como resíduo de biorefinarias e indústrias de papel e celulose. Todavia, a lignina representa uma fonte inexplorada de compostos aromáticos que podem ser convertidos em moléculas de alto valor agregado. O ácido ferúlico (FA) é um dos principais componentes da lignina e apresenta potente capacidade antioxidante, podendo ser aproveitado pelas indústrias farmacêutica e cosmética, além de ser um importante precursor para outras moléculas de interesse comercial, como eugenol, vanilina e álcool coniferílico. A bactéria degradadora de lignina, Rhodococcus jostii RHA1, utilizando a peroxidase DyB, é capaz de despolimerizar a lignina em compostos de baixo peso molecular, como o ácido ferúlico, os quais são catabolizados. Devido a seu metabolismo robusto e versátil, espécies de Rhodococcus tem sido alvo de interesse biotecnológico; todavia, a ausência de ferramentas moleculares de manipulação genética têm dificultado a exploração dos recursos destes microorganismos. Neste projeto, propomos desenvolver um novo vetor para expressão do sistema CRISPR/Cas9 em E. coli e Rhodococcus, promovendo assim rápida e eficiente manipulação genética destes organismos. Utilizaremos este sistema para nocautear o gene CouM do metabolismo de ácidos p-hidróxi-cinâmicos em R. jostii RHA1 e RHA045 ”vdh, levando ao acúmulo de ácido ferúlico quando cultivados em bagaço lignocelulósico de cana-de-açúcar. Esperamos que este projeto estabeleça a primeira aplicação do sistema CRISPR/Cas9 em Rhodococcus, além de desenvolver linhagens e vetores que possam ser usados para valorização de lignina por microorganismos. Também pretendemos disponibilizar o novo vetor E. coli-Rhodococcus para expressão do sistema CRISPR/Cas9 para outros pesquisadores desta área. (AU)