Implantação da plataforma de CRISPR-Cas9 em micobactéria: investigação do sistema ESX-1 na imunogenicidade de BCG

Resumo

A Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis que persiste como um dos maiores problemas de saúde pública. A única vacina existente até hoje contra tuberculose é o Bacilo de Calmette-Guérrin (BCG), uma vacina viva atenuada da cepa patogênica Mycobacterium bovis. Análises moleculares demonstram a deleção de grandes fragmentos no genoma das cepas de BCG e, em especial, a deleção de um fragmento de 9,5 kb denominado RD1, presente na cepa patogênica e ausente em todas as subcepas de BCG como principal causa na atenuação da virulência. A RD1, contém parte do ESX-1, sistema de exportação de fatores de virulência relacionados à patogenicidade, virulência e imunogenicidade. Individualmente, diversos antígenos contidos na RD1 são imunogênicos e, apesar de demonstrarem potencial vacinal, o restabelecimento do sistema de exportação através da reintrodução da RD1 inteira em BCG demonstra resultados mais promissores. Hipotetizamos que a reconstrução da RD1 em seu loci genômico possa restabelecer o sistema de exportação de antígenos, elevar a imunogenicidade e, potencialmente, induzir melhor proteção contra o M. tuberculosis. Neste projeto, sugerimos a reintrodução da RD1 em seu loci genômico através da nova técnica de edição genética CRISPR-Cas9. Existem alguns estudos da utilização desta técnica em micobactéria, mas apenas para silenciamento dos genes. Será necessário estabelecer esta metodologia, portanto, propomos utilizar o sistema repórter GFP como modelo. Será realizada a construção de plasmídeos micobacterianos para a expressão da Cas9 e do sgRNA visando a construção e posterior caracterização genética das cepas mutantes para o knock-in da RD1 em BCG. Será realizada a caracterização funcional do sistema ESX-1 em BCG in vitro e caracterização imunológica de rBCG::RD1 em modelos animais. (AU)