ENGENHEIRAMENTO GENÉTICO DE LINHAGENS FÚNGICAS UTILIZANDO CRISPR/Cas9 MULTIPLEX PARA PRODUZIR COQUETÉIS CELULOLÍTICOS ESPECÍFICOS

Resumo

A completa degradação da biomassa vegetal utilizando enzimas corresponde a uma etapa chave na produção de biocombustíveis no contexto de biorefinarias. A assimilação de oligossacarídeos por microrganismos fermentativos, ao invés de monossacarídeos, é considerada vantajosa uma vez que pode diminuir a competição com possíveis contaminantes, resultando em melhores rendimentos de processo e produtividade. Para esta finalidade, além da necessidade de leveduras engenheiradas capazes de internalizar xilo e celo-oligossacarídeos, faz-se necessário o uso de coquetéis celulolíticos específicos. Fungos filamentosos, como Aspergillus spp., são excelentes candidatos para o desenvolvimento de plataformas para produção de enzimas, principalmente devido a sua alta capacidade de secreção de proteínas. Neste contexto, o principal objetivo desta proposta é implementar o sistema CRISPR/Cas9 multiplex em Aspergillus niger e Aspergillus nidulans visando a inativação de genes que codificam para celobiohidrolases, ²-glicosidases e ²-xilosidases. Estas enzimas foram selecionadas por serem responsáveis pala formação de monossacarídeos. CRISPR/Cas9 multiplex é um sistema inovador que permite a inativação de uma série de genes específicos por truncamento ou deleção. Após a implementação da técnica em ambas as espécies de Aspergillus, nós realizaremos um ou mais testes de inativação gênica para obtermos linhagens fúngicas produtoras de coquetéis enzimáticos específicos que possam degradar a biomassa vegetal parcialmente com formação de produtos enriquecidos em termos de oligossacarídeos, comparado com as linhagens parentais. Esperamos aprender esta tecnologia sob a supervisão do Prof. Uffe H. Mortensen no Departamento de Biotecnologia e Biomedicina na Universidade Técnica da Dinamarca (DTU), que é um especialista na tecnologia CRISPR/Cas9 em Aspergillus, uma tecnologia que ainda não foi desenvolvida no Brasil.