Ensaios de validação de linhagens de Trypanosoma cruzi editadas por CRISPR/Cas9.

• Processo: 26/06497-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2026
• Data de Término da vigência: 31 de março de 2027
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Simone Guedes Calderano
• Beneficiário: Aleticia Batista Pantoja
• Instituição Sede: Instituto Butantan. São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 24/20554-5 - Investigação dos Mecanismos de Controle da Proliferação Celular em Trypanosoma cruzi e seu Impacto na Resistência ao Benznidazol, AP.R
• Assunto(s): Proteína 9 associada à CRISPR Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) Biologia molecular
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cas9 | Crispr | Rt-Pcr | Validação de linhagens editadas | Biologia Molecular

Resumo

A edição genética por CRISPR/Cas9 em Trypanosoma cruzi é uma ferramenta versátil, simples e rápida de ser realizada. Diversas linhagens celulares podem ser geradas com edições de deleção de genes, inserção de etiquetas, inserção de mutações dirigidas entre outras. Utilizando o sistema CRISPR/Cas9, nosso grupo de pesquisa tem gerados linhagens Knockout (de um ou ambos os alelos), linhagens onde proteínas são expressas conjugadas a diferentes etiquetas (Myc, Flag, HA) e enzimas (TurboID, luciferase). Estas linhagens precisam passar por diversas etapas de validação, para garantir a robustez dos dados gerados a partir delas. Nas linhagens KO, é fundamental verificar: se o gene correto foi deletado, se o gene de resistência foi inserido no locus apropriado, quantos alelos foram removidos e se há redução nos níveis de mRNA. Já para as linhagens onde as proteínas são expressas conjugadas a etiquetas, é preciso avaliar se há mudanças no fenótipo da curva de crescimento, da distribuição da população nas diferentes fases do ciclo celular e na morfologia celular.Assim, o objeto do projeto é validar as linhagens geradas por CRISPR/Cas9 de Trypanosoma cruzi dos diferentes projetos do grupo de pesquisa, por meio de diferentes técnicas que permitam avaliar se a adição de etiquetas nas proteínas alvo altera alguns parâmetros fenotípicos específicos e validar a diminuição da expressão de genes deletados (um ou ambos os alelos). Ao final, o aluno bolsista terá aprendido diversas técnicas de biologia celular e molecular, além de contribuir para o desenvolvimento de todos os projetos em andamento no laboratório. (AU)