Efeitos de baixa tensão de oxigênio na eficiência da reprogramação e manutenção de células-tronco pluripotentes induzidas de equino

Resumo

Por ser uma espécie conectada diretamente ao trabalho físico, a espécie equina frequentemente está exposta a injúrias em tendões, ligamentos e ossos, e é suscetível a doenças como a osteoartrite, por exemplo, condições essas ainda sem opções de tratamento eficazes, e que em casos extremos levam o animal à perda das funções motoras. Sendo assim, estudos relacionados a medicina regenerativa são significativos para essa espécie. A tecnologia das células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) é uma ferramenta promissora tanto para a pesquisa básica quanto para a medicina regenerativa. Porém, nem sempre há sucesso nesse processo, sendo que algumas das células submetidas a ele ficam em um estado intermediário entre a pluripotência e a célula diferenciada. Tendo em vista a importância do estudo de métodos que complementam e auxiliam a reprogramação celular, uma vez que ele traz conhecimentos básicos que levam a maior eficácia na produção de células iPSC, e que a tensão de oxigênio empregada nos cultivos e na reprogramação celulares influencia no desenvolvimento e manutenção das iPSC, células de tecido adiposo de equinos adultos serão reprogramadas através de dois métodos, um empregando vetores lentivirais (VL) contendo os 4 fatores de transcrição [Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc (iPSC 4FT)] e o outro empregando vetores epissomais, método livre de integração ao genoma da célula. Tencionando a aplicação das iPSC na medicina regenerativa, o emprego de um sistema de reprogramação não integrativo se faz importante. Atualmente, não há na literatura relatos de iPSC equinas se não por vetores integrativos, e nem da influência exercida pelo oxigênio no processo de reprogramação ou cultivo dessas células, o que torna o presente estudo essencial. Ambas as iPSC reprogramadas por VL e pelo método epissomal serão divididas em cultivos em condições de: 5% CO2, 5% O2 e 90%N2, ou 5%CO2, 20%O2 e 75%N2. As colônias obtidas serão caracterizadas quanto à eficiência do processo de reprogramação, capacidade de diferenciações in vitro e in vivo, imunofenotipagem e avaliação da expressão gênica. Além disso, para avaliar a influência do oxigênio, a ativação da via glicolítica, presença de radicais livres, morfologia mitocondrial, presença de potencial de membrana mitocondrial, metilação global do DNA, e avaliação do perfil de microRNAs serão avaliados, bem como uma cariotipagem para averiguação de possíveis alterações cromossômicas. Ao final das avaliações será possível demonstrar as alterações causadas pelo oxigênio, e elucidar sua influência no processo de reprogramação e manutenção das iPSC equinas.